高光谱图像法对稻谷贮藏中五种常见真菌生长拟合及区分

肖　慧,王振杰,孙　晔,顾欣哲,屠　康,都立辉,潘磊庆,*

(1.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;2.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏南京 210023)



高光谱图像法对稻谷贮藏中五种常见真菌生长拟合及区分

肖慧1,王振杰1,孙晔1,顾欣哲1,屠康1,都立辉2,潘磊庆1,*

(1.南京农业大学食品科技学院,江苏南京 210095;2.南京财经大学食品科学与工程学院,江苏南京 210023)

利用高光谱成像系统(HIS)获取稻谷贮藏中常见真菌(黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、桔青霉)在马铃薯葡萄糖琼脂板上培养期间的高光谱图像,波峰709 nm处的光谱值和全波段光谱值的第一主成分得分两种方法构建真菌Gompertz函数的生长模拟模型。Gompertz函数拟合结果显示,五种真菌基于全波段光谱值PCA分析后的第一主成分得分建立的生长拟合模型R2为0.1781～0.9501,基于波峰709 nm光谱值建立的拟合模型R2为0.9095～0.9679,效果明显优于第一主成分得分的建模效果。另外,主成分分析(PCA)结合偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)可以区分五种不同菌种。其中,训练集和测试集中,PLS-DA模型对培养48 h的黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、桔青霉四种真菌及对照组的区分准确率为100%;而对杂色曲霉,训练集区分准确率为100%,测试集的区分率为33.33%。结果表明高光谱图像技术能够用来对真菌种类进行区分。

高光谱图像,稻谷,真菌,生长拟合,区分

稻谷是我国主要储备粮种。稻谷产量约占全国粮食总产量的38.3%[1]。稻谷贮藏中的真菌危害是一种常见现象,稻谷在贮藏中的真菌共有十几种,主要属于曲霉类和青霉类[2]。郜海燕等[3]对浙江省农家稻谷的调查发现在稻谷贮藏中曲霉属(Aspergillusspp.)、青霉属(Penicilliumspp.)、镰孢霉属(Fusariumspp.)、弯孢霉属(Curvulariaspp.)、链格孢霉属(Alternariaspp.)为优势菌,且在不同的地区及贮藏方式中,真菌的种类基本一致。稻谷中真菌的存在使得稻谷在贮藏过程中极易发生病变,加速了稻谷的变色,影响稻谷品质,造成稻谷的损失。同时,污染稻谷的霉菌会产生具有致畸、致癌、致突变“三致”效应的霉菌毒素,危害人体健康[4]。因此,建立稻谷贮藏常见真菌生长模型能对稻谷贮藏中真菌进行及时检测及预测,降低稻谷损失,避免霉变稻谷造成消费者的食用风险。国外有专家采用修正的Gompertz模型,在玉米提取液培养基上模拟了影响霉菌菌种生长因素的研究[5-6]。Sautour等[5]利用PDA培养基对几种霉菌的生长与水分活度之间的关系进行了模拟研究。李瑞芳等[8]利用PDA培养基对影响黄曲霉生长的因素进行了模拟研究。Gibson和Hocking[9]在1997年发表的综述中描述了建立真菌生长模型的原则,并总结了在酵母菌及霉菌中应用的建模及预测技术。Baert等[10]建立了温度对苹果中青霉菌生长速率及迟滞期影响的模拟模型。青霉菌的模拟研究报道尚少,而且建立在高光谱基础上的稻谷贮藏真菌的生长模拟和区分也没有报道。

高光谱图像技术是20世纪80年代发展起来的新技术,把传统的成像技术与光谱技术有效结合,其光谱技术可以检测产品的物理结构和化学成分;图像技术可以反映外部特征,是用于农产品无损检测中快速、准确的技术之一,具有较大应用前景[11]。高光谱图像技术在遥感测量上有着成熟的应用背景,已在多领域取得了成功。近年来国内外的研究表明高光谱技术已被广泛应用于水果的无损检测中,Alan等[12]运用该技术对苹果表面动物排泄物污染进行了检测,Juan等[13]利用该技术对不同种苹果表面的损伤进行了检测,Qin 等[14]对腻斑病、溃烂果、虫害果、黑变病果及带疤痕果等210个柑橘样品进行了识别及分类。但高光谱图像在稻谷贮藏病害研究很少,本研究旨在分析稻谷储藏中主要真菌(米曲霉、杂色曲霉、黑曲霉、构巢曲霉、桔青霉)平板培养的高光谱特征,并通过对比信息,实现五种真菌的生长拟合和识别工作,为进一步实现稻谷基质储藏真菌病害的生长和拟合奠定基础,进而为稻谷真菌病害的准确检测和监测提供帮助。

1　材料和方法

1.1材料与仪器

稻谷储藏主要的五种真菌黑曲霉(Asp.Niger,GIM3.462)、米曲霉(Asp.Oryzae,GIM3.470)、杂色曲霉(Asp.Versicolor,GIM3.473)、构巢曲霉(Asp.Nidulans,GIM3.270)和桔青霉(P.Citrinum,GIM3.458),由广东菌种保藏中心购入。

高光谱系统装置构成如图1所示,系统由六部分组成:ICL-B1620 CCD相机(美国Imperx公司)、ImSpectorV10E成像光谱仪(芬兰Specim公司)、可变焦镜头、3900ER可调谐光源(美国Illumination Technologies公司)、IRCP0076视觉平台(中国台湾Isuzu公司)、配有Spectral Image图像采集软件的计算机(中国台湾Isuzu公司)[15]。

菌种培养用PDA培养基,培养基组成为马铃薯浸粉5 g、葡萄糖20 g、NaCl 5 g、琼脂15 g、氯霉素0.1 g、水1000 mL、pH5.8～pH6.2。每个培养皿含有的培养基体积为20±5 mL,培养基厚度为2.5±0.5 mm。

1.2实验方法

1.2.1样本制备将保藏的5种菌种在PDA培养基上28 ℃,75%相对湿度二次活化后,用无菌生理盐水反复冲洗,制成菌悬浮液,利用血球计数板,将菌悬液稀释至浓度为4×104cfu/mL待用。

共准备550个培养基,其中空白对照90个,黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、桔青霉四种真菌的平板样本各90个,构巢曲霉平板样本100个。

1.2.2高光谱图像采集采用高光谱图像检测系统的反射模式对五种真菌进行检测,有效波长范围为400～1000 nm。实验参数为:相机镜头和线光源距离样本分别为30 cm和20.5 cm,光照强度为30 W,以45°对准样本,曝光时间为2.5 ms,输送速度为2.4 mm/sec。

550个样本同时培养,每种菌及空白在0、8、16、24、36、48、60、84、108 h各拿出10个进行高光谱检测(构巢曲霉生长较慢,培养时间增加至132 h,即高光谱检测增加132 h测定时间点)。共获得550个样本的高光谱图像数据。

分别用全黑和全白板获得高光谱图像,对样品高光谱图像进行校正处理[16]。根据式(1)计算出校正后的相对图像Rc:

式(1)

式中,R0为原始高光谱透射图像;D为全黑的标定图像;W为全白的标定图像;Rc为标定后高光谱透射图像。

1.2.3高光谱图像特征信息的提取利用ENVI(version 4.8,中国Esri公司)软件,选择培养基中菌落生长的地方大小约1000个像素点的区域作为感兴趣区域(ROI),计算高光谱图像ROI区域平均光谱值。实验中提取了所有样本在波峰709 nm处的光谱响应值(方法Ⅰ)、400～1000 nm波段内光谱值进行PCA主成分分析后的第一主成分的得分值(方法Ⅱ)[17]作为后续拟合的特征信息。

1.2.4高光谱数据的拟合将每种菌到达最高光谱响应值前的各个检测时间点的所有样本进行建模拟合。通过MATLAB(version 7.1,美国Mathworks公司)统计工具箱中Curve Fitting Tool建立五种真菌光谱值随时间变化的生长曲线,根据拟合模型决定系数(R2)比较模型效果。

1.2.5PLS-DA建立判别模型本文中,偏最小二乘判别分析法(PLS-DA)被用来建立判别模型[18],区分五种真菌及对照组。其中,70%的样本用来构建模型,30%用来验证模型。经过主成分分析(PCA),第一主成分(PC1)及第二主成分(PC2)能代表样品的主要特征信息,PC1及PC2得分被用来建立PLS-DA模型。

图1　高光谱图像系统示意图Fig.1　The schematic diagram of hyperspectral imaging system

2　结果与分析

2.1五种真菌不同生长阶段的高光谱图像

图2是高光谱图像技术采集的不同真菌图像。可以看出黑曲霉在0～108 h颜色变化最明显,早期菌落为白色,48 h菌落变黄,后颜色随时间加深,在108 h平板遍布黑色菌落。构巢曲霉生长最慢,48 h平板才开始出现明显菌落。米曲霉与杂色曲霉颜色变化相似(早期为白色,后变为黄色),16 h平板出现明显菌落,48 h平板遍布白色菌落,后白色菌落逐渐变黄,颜色随时间加深,但杂色曲霉的菌落较米曲霉菌落更为光滑。桔青霉24 h平板出现明显但少量菌落,后菌落数增加,白色更为明显,60 h桔青霉呈现灰白色。

图2　不同菌种的高光谱图像Fig.2　Typical reflectance hyperspectralimages of different fungi

五种真菌在检测早期菌丝呈现白色,属于生长早期,在生长中后期,不同菌种会产生各自的特征颜色。

2.2不同真菌的光谱特征

图3为不同培养时间的光谱响应值曲线(以杂色曲霉为例)。在400～1000 nm的光谱范围内,五种菌的光谱值随时间的延长都是先呈上升趋势,达到最大光谱响应值后呈现下降趋势,最大反射光谱值出现在波长为709 nm处的波峰。黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、桔青霉五种真菌达到最大反射光谱值的时间分别为60、60、60、108、60 h。

图3　杂色曲霉的平均光谱Fig.3　Average original spectra of Asp. Versicolor

由于真菌生长较慢,黑曲霉、米曲霉,杂色曲霉、桔青霉四种真菌在0～16 h还未在平板上形成明显菌落,且生长早期菌落呈现白色,故0～16 h光谱变化并不明显。构巢曲霉较其他四种霉菌的生长更为缓慢,0～36 h内光谱值变化并不明显,在光谱响应值曲线图中表现为几条光谱响应值曲线重合度较大。随着时间的推移,白色菌丝更明显,对光的反射也就更大,光谱反射值随着生长时间的延长而增大,黑曲霉、米曲霉,杂色曲霉、桔青霉四种真菌均在24～60 h有一个较大的升高,并在60 h达到最高的光谱响应值,真菌生长迅速。构巢曲霉在60～108 h有一个较大光谱响应值的升高。此后由于五种真菌的菌丝体产生大量分生孢子,呈现出不同的颜色,且随时间的推移颜色越深(黑曲霉为黑色,米曲霉、杂色曲霉为黄色,构巢曲霉为灰色,桔青霉为灰白色),光谱响应值随时间的延长而呈现下降趋势,其中黑曲霉下降趋势最为明显。由此可看出光谱值的变化反映了真菌的生长状态,与2.1中真菌高光谱图像反映的结果相一致。

2.3高光谱图像特征参数对五种真菌的Gompertz拟合

预测微生物学研究者提出了不少用于描述微生物动力学生长的初级模型,主要包括:Gompertz函数、指数函数、线形模型(Linear model)、热致死D值、修正的Monod 模型、逻辑斯蒂克函数(Logistic function)等。在众多的初级微生物生长动力学模型中,Gompertz模型[19-25]由于较好的拟合度被广泛的应用。美国农业部开发的病原菌模型程序PMP(Pathogen Modeling Program)和英国农粮渔部开发的食品微型模型FM(Food Micro-model)都是以Gompertz函数作为初级模型。

利用1.2.4所述的两种方法处理提取真菌的高光谱图像特征,将得到的两种参数(波峰709 nm处光谱值;全波段第一主成分得分值)分别对时间进行Gompertz拟合,对比模型决定系数(R2)如表1所示,结果显示波峰处数据的拟合效果明显优于第一主成分得分的拟合效果,分析其原因可能为主成分分析仅去除数据之间的线性相关性,第一主成分得分并不能完全代表真菌生长的特征信息[26]。

表1　两种高光谱参数的Gompertz生长拟合模型R2比较

注:方法Ⅰ,波峰处(709 nm)的光谱值;方法Ⅱ,400～1000 nm波段内光谱值进行PCA主成分分析后的第一主成分的得分值。

黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、桔青霉五种真菌波峰数据拟合曲线如图4所示,拟合方程分别为:

图4　709 nm峰值处光谱响应值Gompertz拟合曲线Fig.4　The curves of Gompertz model fitting based on the spectral response value of the wave peak at 709 nm

2.4PLS-DA区分五种菌种

在全波段范围内,由于光的色散现象导致真菌的光谱值随菌落的生长而增大,光的色散随着菌丝的生长而产生,不同菌丝间色散程度会存在差异[27-28],因此通过光学方法可以区分不同菌种。如图5所示,对不同培养时间的全波段(400～1000 nm)光谱值进行PCA分析,以区分不同菌种和对照组。结果显示,在生长早期,由于五种菌种生长较慢,主要呈现培养基的透明颜色,较难区分,在0 h(图5A)、8 h(图5B)、16 h(图5C)、24 h(图5D)、36 h(图5E)菌种之间存在相互重叠。在培养48 h后五种真菌的光谱响应值出现差异,易于区分。而且五个实验组在48 h区分最为明显(图8F),因此可以利用光谱响应值来区分培养48 h的五种菌及对照组。

图5　基于不同菌种高光谱全波段响应值的主成分分析Fig.5　Results of PCA for different fungi during the growth注：A:0 h;B:8 h;C:16 h;D:24 h;E:36 h;F:48 h;G:60 h;H:84 h;I:108 h。

根据PCA分析的结果,本文选取培养48 h的菌种加以建模区分,PLS-DA模型区分结果如表1所示。黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、桔青霉和对照组测试集的区分准确率分别为100%、100%、100%、100%、33.33%、100%。48 h时,杂色曲霉和米曲霉平板均遍布白色菌丝(如图2所示),此阶段菌丝还未呈现各自特征颜色,在光谱响应值中表现为光谱响应值较为相似,易造成误判,在判定结果中显示为杂色曲霉测试集区分准确率略低。对照组与五种菌之间的平均区分准确率达88.89%。上述结果表明,高光谱图像技术能够区分五种不同真菌。

3　结论

本实验对稻谷贮藏中5种常见真菌如黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、桔青霉进行了光谱响应值随时间变化拟合效果对比,并利用PLS-DA模型加以区分。结果显示,基于高光谱图像中可以看出,五种真菌在0～24 h生长缓慢,光谱响应值在此阶段无明显变化。此后进入对数生长期,菌落数量随时间增加,白色菌丝反射越为明显,光谱响应值随时间的延长而增大,五种真菌菌丝体上端分生孢子开始形成(达到最大光谱响应值)并逐渐显示出各自的颜色,此后光谱响应值随时间的延长而呈现下降趋势。

表2　PLS-DA模型区分5种真菌培养48 h的结果

对五种真菌采用Gompertz模型拟合的结果显示,黑曲霉、米曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、桔青霉五种真菌峰值(709 nm)数据的生长拟合模型R2为0.9095～0.9679,而第一主成分得分数据的生长拟合模型R2为0.1781～0.9501,峰值数据的拟合效果明显优于第一主成分得分的拟合效果,原因可能是在本次实验中第一主成分的得分不能完全代表菌落生长的特征信息,造成建模效果较差。

利用高光谱反射光谱的全波段信息对五种真菌9个时间点做PCA聚类分析,结果显示在48 h五种真菌最易于区分,PLS-DA模型对培养48 h的黑曲霉、米曲霉、构巢曲霉、桔青霉四种真菌及对照组的训练集、测试集的区分准确率为100%;对杂色曲霉训练集的区分准确率为100%,测试组的区分率为33.33%。此结果表明利用高光谱特征可以实现对该稻谷储藏中五种真菌的生长拟合和区分,为进一步对稻谷储藏病害的研究奠定了基础。

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Growth simulation and discrimination of five fungi from rice storage using hyperspectral reflectance imaging technique

XIAO Hui1,WANG Zhen-jie1,SUN Ye1,GU Xin-zhe1,TU Kang1,DU Li-hui2,PAN Lei-qing1,*

(1.College of Food Science and Technology,Nanjing Agricultural University,Nanjing 210095,China;2.College of Food Science and Engineering,Nanjing University of Finance & Economics,Nanjing 210023,China)

Hyperspectral imaging system(HIS)was used in this study to acquire the spectral responses of fungi(Asp.Niger,Asp.Oryzae,Asp.Versicolor,Asp.Nidulans,P.Citrinum)inoculated on potato dextrose agar plates. Two methods for calculating HIS parameters,including the spectral response values of the wave peak at 709 nm,and the scores of the first principal component of the whole spectral range(400～1000 nm)using principal component analysis(PCA),were used to simulate the growth of fungi. The results of Gompertz model revealed that the coefficients of determination(R2)of five fungi based on the score of the first principal component were 0.1781～0.9501,whileR2with 0.9095～0.9679 based on the spectral response value of the wave peak at 709 nm showed better aptitude than the previous method. In addition,fungi species can be discriminated by PCA and partial least squares discrimination analysis(PLSDA)using the spectral information of the full wavelength range. All the classification accuracy of the test group and training group sets by PLSDA models for four fungi(Asp.Niger,Asp.Oryzae,Asp.Nidulans,P.Citrinum)cultured for 48 h were 100%,with the exception of 33.33% for the classification accuracy of training group ofAsp.Versicolor. This paper supplied a new technique and useful information for further study into detecting rice spoilage caused by fungi based on HIS.

hyperspectral imaging;rice;fungi;growth simulation;discrimination

2015-12-04

肖慧(1994-)，女，硕士，研究方向:农产品无损检测和控制，E-mail:hui.x.1010@outlook.com。

潘磊庆(1980-)，男，博士，副教授，研究方向：农产品无损检测，E-mail:pan_leiqing@njau.edu.cn。

粮食公益性行业科研专项经费资助项目(201313002-01)；国家科技支撑项目(2015BAD19B03)；中央高校基本科研业务费专项(KYLH201504)和国家自然科学基金项目(31101282)。

TS255.4

A

1002-0306(2016)13-0276-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.048