高γ-氨基丁酸绿豆酸面团面包营养与烘焙特性

苏晓琴,张可欣,黄卫宁,*,刘若诗,陈军民,张　峦,李志斌,傅贵华,RAYAS-DUARTE Patrica

(1.江南大学,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;2.南京百合贝可生物科技有限公司,江苏南京 211000;3.福建省麦都食品发展有限公司,福建泉州 362213;4.美国俄克拉荷马州立大学农产品与食品研究中心,俄克拉荷马州 斯蒂尔沃特 74078-6055)



高γ-氨基丁酸绿豆酸面团面包营养与烘焙特性

苏晓琴1,张可欣1,黄卫宁1,*,刘若诗2,陈军民2,张峦2,李志斌3,傅贵华3,RAYAS-DUARTE Patrica4

(1.江南大学,食品科学与技术国家重点实验室,江苏无锡 214122;2.南京百合贝可生物科技有限公司,江苏南京 211000;3.福建省麦都食品发展有限公司,福建泉州 362213;4.美国俄克拉荷马州立大学农产品与食品研究中心,俄克拉荷马州 斯蒂尔沃特 74078-6055)

通过改良纸层析(modified paper chromatography,MPC)、高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC)、16S rRNA基因测序、质构仪(texture anylyzer,TA)及感官分析方法从传统发酵米粉中分离筛选得到一株产γ-氨基丁酸的布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri,L.bu),以小麦面包和绿豆面包为对照,研究了该乳酸菌发酵对绿豆酸面团面包营养与烘焙特性的影响。结果表明:筛选得到一株产γ-氨基丁酸的布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri,L.bu),其γ-氨基丁酸产量为3.66±0.05 g/L;L.bu发酵的绿豆酸面团面包中总游离氨基酸含量分别为小麦面包和绿豆面包的3.36和2.77倍,其中γ-氨基丁酸含量为23.44 mg/100 g,显著高于绿豆面包和小麦面包;与绿豆面包相比,绿豆酸面团面包全质构特性得到显著改善,面包品质有所提升;酸面团的引入,使其各项感官特性评分显著高于绿豆面包,整体可接受度接近小麦面包。

γ-氨基丁酸,绿豆,乳酸菌,酸面团,烘焙

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是由谷氨酸脱羧酶(Glutamate decarboxylase,GAD)催化转化谷氨酸后得到的一种非蛋白质氨基酸,是哺乳动物中枢神经系统的抑制性神经递质之一,参与多种代谢途径[1]。研究表明GABA具有预防糖尿病[2]、降血压[3-4]、利尿、安神等效果[5-6],可在植物和微生物中富集得到[7]。绿豆作为一种食药兼用的豆科植物[8],是蛋白质、膳食纤维和碳水化合物的重要摄入来源[9],其氨基酸种类齐全,GABA的前体物质谷氨酸含量较高[10],且具有可在发芽时被激活的内源性GAD,常以发芽处理富集绿豆中的GABA[11]。

酸面团发酵技术可有效地提高富含膳食纤维面包的营养、比容、质构[12-13]和风味特性[14],并增加其生物活性物质含量[15]。乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是酸面团这一复杂生态系统中的主要优势菌群之一[16],其中最常见的是乳杆菌属[17]。LAB作为一种食品安全级微生物,是微生物法合成 GABA 的重要菌种之一[18],常被用以生产功能性发酵食品。传统发酵食品是产 GABA 乳酸菌重要的分离来源,其酸性的环境、丰富的底物(谷氨酸)为乳酸菌合成GABA提供了有利的条件[19]。我国传统发酵米粉以厌氧发酵为主,乳酸菌为发酵过程中的主要优势菌群[20]。目前从传统发酵米粉中分离筛选产GABA菌株,并制作富含GABA的绿豆酸面团面包的研究还未见报道。

本研究以湖南常德传统发酵米粉为筛选对象,通过改良纸层析法和高效液相色谱法筛选,得到产GABA的乳酸菌,通过表型分析和16S rRNA 基因鉴定的方法,确定其种属。选择绿豆粉作为目标菌株的发酵基质。以小麦面包(WB)、绿豆粉面包(MB)为对照,研究产GABA乳酸菌发酵对绿豆酸面团面包营养、质构和感官特性的影响,为开发富含GABA的功能性发酵食品的应用奠定理论基础。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

MRS肉汤培养基杭州百思生物技术有限公司;细菌基因组试剂盒、溶菌酶天根生化科技(北京)有限公司;DNA Marker DL 2000、PCR试剂大连Takara公司;放线菌酮:上海宝曼生物科技有限公司;甘油、无水乙醇、琼脂粉、氯化钠、碳酸钙、冰醋酸、正丁醇、茚三酮和磷酸吡哆醛等试剂国药集团化学试剂有限公司;GABA、L-谷氨酸美国Sigma公司;面包粉鹏泰(秦皇岛)面粉有限公司;即发活性干酵母广东省梅山马利酵母有限公司;起酥油中粮东海粮油工业(张家港)有限公司;绿豆粉阜新佳麦粮食有限公司;白砂糖、盐市售;传统发酵米粉采自湖南常德地区。

FE20型实验室pH计梅特勒仪器(上海)有限公司;LZDX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌器上海申安医疗器械厂;TH-B-402无菌操作台无锡一净净化仪器设备厂;SPX-150C型恒温恒湿培养箱上海博迅实业有限公司医疗设备厂;厌氧培养袋、厌氧产气袋、厌氧指示剂日本三菱公司;XSP-10C 型电子显微镜上海彼爱姆光学仪器制造有限公司;JY20002型电子天平上海良平仪器仪表有限公司;P型薄层色谱展开缸上海信谊仪器厂有限公司;GZX9240 BZE数显鼓风干燥箱上海博讯实业有限公司医疗设备;PC300型PCR仪Eppendorf Master personal;DYY-8C型电泳仪北京六一仪器厂;凝胶成像仪BIO-RAD;TDL-5离心机上海安亭科学仪器厂;SM-25搅拌机、SPC-40SP醒发箱、SM-503烤箱、SM-302 切片机新麦机械(无锡)公司;CT3质构仪美国Brookfield公司。

1.2实验方法

1.2.1乳酸菌的分离、纯化及保藏取5 mL米粉发酵液加到45 mL无菌生理盐水中制成悬浮液,进行梯度稀释,选取合适梯度,取100 μL稀释液涂布于含碳酸钙(3 g/L)的MRS固体培养基(含0.01%放线菌酮)[21]。37 ℃下培养48 h,挑取产生CaCO3透明圈、菌落形态不同的菌落在MRS固体培养基上反复划线纯化。选取过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性的菌株进行观察、编号、记录菌落形态并保藏于MRS斜面上保藏(4 ℃),备用。

1.2.2产GABA乳酸菌的初筛菌株分别接入MRS液体培养基中,37 ℃培养24 h。按体积分数4%的接种量接种至mMRS液体培养基(MRS肉汤培养基中添加质量分数1%的L-谷氨酸钠)中,30 ℃静置培养48 h后,取发酵液1 mL,沸水浴5 min后离心(12000×g,5 min),取上清液,4 ℃保存,待测。GABA定性分析[22]:展开剂(正丁醇-冰醋酸-水=12-3-5(v/v/v))中加入0.4%的茚三酮作为显色剂,待测样品点样2 μL。采用新华一号层析纸展开2 h后于90 ℃下显色10 min。同时以浓度为1 g/L的GABA和L-谷氨酸钠的标准品作对照。

1.2.3产GABA乳酸菌的复筛通过改良纸层析法[23],初步筛选确定具有产GABA活性的乳酸菌后,用高效液相色谱法定量测定其发酵上清液中的GABA含量。使用Agilent 1100液相色谱配合以338 nm的UV检测器进行分析。色谱条件:ODS Hypersil色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为20 mmol/L醋酸钠的甲醇-乙腈(1∶2(V/V))溶液,流速1.0 mL/min,柱温40 ℃。样品处理:取2 mL发酵液和2 mL的10 g/100 mL的三氯乙酸(TCA),混匀,超声波破碎1 h,用双层滤纸过滤。取滤液1 mL滤液,10000×g离心10 min,上清液用邻苯二甲醛进行柱前衍生化,HPLC进行测定。

1.2.4产GABA乳酸菌DNA的提取、PCR扩增与16S rRNA基因测序使用细菌基因组DNA提取试剂盒提取产GABA乳酸菌的DNA,用微量紫外分光光度计检测其OD值(A260/A280)和浓度。对其进行PCR(Polymerase Chain Reaction)扩增,得到的产物通过琼脂糖凝胶电泳检测纯度,将纯度符合要求的16S rRNA片段送往上海桑尼生物技术有限公司进行测序[24-25]。得到的菌株序列在GenBank数据库中进行BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)同源性比对分析。检索与16S rRNA序列同源性最高的已知分类地位的菌种,确定其种属。

1.2.5绿豆面团和绿豆酸面团制作绿豆面团:绿豆粉20 g,含磷酸吡哆醛10 μmol/L的去离子水80 g(DY=500)。面团搅拌混合均匀,不进行发酵培养。绿豆酸面团:绿豆粉20 g,含磷酸吡哆醛10 μmol/L的去离子水80 g(DY=500)。面团中乳酸菌初始接菌量107CFU/g。面团搅拌均匀后,30 ℃下摇床(120 r/min)培养48 h。

1.2.6小麦面包、绿豆面包和绿豆酸面团面包制作小麦面包、绿豆面包和绿豆酸面团面包制作配方见表1。除黄油外,所有配料慢速搅拌3.0 min,混合均匀;快速搅拌3.0 min,搅拌成团。加入黄油后,慢速搅拌0.5 min,快速搅拌3.0 min至面筋网络结构形成。取出面团,室温下覆膜静置10 min,分割成型(90 g/个)。醒发箱(28 ℃,相对湿度85%)内醒发90 min后,放入烤箱(上火170 ℃,下火210 ℃)烘烤20 min。

表1　小麦面包、绿豆面包和绿豆酸面团面包配方

注:-表示未添加该物质。

1.2.7小麦面包、绿豆面包和绿豆酸面团面包品质的测定

1.2.7.1面包中游离氨基酸(含GABA)含量称取1.000 g左右撕碎的面包于25 mL容量瓶中,用5 g/100 mL的三氯乙酸(TCA)定容,超声波破碎1 h,用双层滤纸过滤。取1 mL滤液,10000×g离心10 min,上清液用邻苯二甲醛进行柱前衍生化,HPLC测定游离氨基酸含量[23]。色谱条件与1.2.4一致,将测试曲线与标准氨基酸混合液的校正曲线对比,根据保留时间和标准化合物的峰面积,对检测出的氨基酸进行定性定量分析[26]。

1.2.7.2面包比容面包室温下冷却2 h,测定面包质量,采用菜籽替代法测定面包体积,计算面包比容[27]。重复实验三次,取平均值。

1.2.7.3面包全质构分析面包冷却2 h后,用面包切片机将面包切成12.0 mm均匀薄片,取中间两片,利用质构仪的TPA测试模式测定面包芯全质构。参数设置[12]:探头型号P/36,测试前速率3.0 mm/s,测试速率1.0 mm/s,测试后速率3.0 mm/s,压缩程度50%,感应力5 g,压缩时间间隔1 s。重复实验三次,取平均值。

1.2.7.4面包感官评定采用9分嗜好评分法[27],进行面包感官评定。对小麦面包、绿豆面包和绿豆酸面团面包的外观、色泽、风味、口感及整体可接受度进行评分,小组成员由30个受过感官评定培训的人员(15名女性,15名男性)组成。评分标准:1～9分别代表极度不喜欢、非常不喜欢、适度不喜欢、轻微不喜欢、既不讨厌也不喜欢、轻微喜欢、适度喜欢、非常喜欢和极度喜欢。

1.2.8数据分析采用SPSS 17.0及Microsoft Office Excel 2013分析软件进行数据统计分析,运用方差分析法(ANOVA)进行显著性分析,显著差异水平取p<0.05。

2　结果与分析

2.1传统发酵米粉中菌株分离纯化、筛选及鉴定

传统发酵米粉样品经分离纯化后得到152株产乳酸、过氧化氢酶阴性且革兰氏阳性的菌株,初步判断为乳酸菌。改良纸层析结果显示,1株乳酸菌具有与GABA标样相同的Rf值,即具有产GABA能力(图1)。与1 g/L的GABA标样层析斑点相比,其层析斑点颜色较深,直径较大,可判断其发酵液中GABA含量高于1 g/L。通过高效液相色谱法(HPLC)精确定量菌株发酵液中GABA含量为3.66±0.05 g/L,与纸层析结果基本一致。

图1　纸层析结果Fig.1　Results of paper chromatography

目标菌株菌落形态均为乳白色圆形,表面光滑温润,整体圆润隆起,边缘整齐,直径约1 mm,是典型的乳酸菌菌落特征(图2a),可初步判断为乳酸菌,革兰氏染色镜检确定为杆菌(图2b)。16S rRNA基因测序结果与基因库中参考菌株LactobacillusbuchneristrainJCM 1115 对比,同源性达99%,所以将其鉴定为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneris,L.bu),登录号为KU856520。Cho[28]等从朝鲜传统泡菜中也曾分离出高产GABA 的布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)。

图2　L.bu菌落形态(a)及镜检结果(b)(100×)Fig.2　Colonies(a)and morphology(b)of L.bu

2.2面包制作

L.bu作为绿豆酸面团发酵乳酸菌,按1.2.6制作实验面包:小麦面包(WB),绿豆面包(MB),L.bu发酵的绿豆酸面团面包(MSB)。

2.3面包游离氨基酸及GABA含量

图3显示四种面包中均含有18种游离氨基酸,其中天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、GABA、酪氨酸和脯氨酸含量相对较高。绿豆粉中各类氨基酸含量较为丰富[8],使MB总游离氨基酸含量提高到了88.29 mg/100 g,高于WB(72.94 mg/100 g)。添加绿豆粉后的MB,除丝氨酸和苯丙氨酸外,其余氨基酸含量都高于WB(图3)。以赖氨酸为例,与WB相比,MB中赖氨酸含量提高了33.9%,因为绿豆粉中蛋白质以球蛋白为主,球蛋白氨基酸组成中赖氨酸丰富,绿豆粉的添加使得小麦面包中原本含量较少赖氨酸得到了显著提升[8]。由图3可知,与MB相比,MSB中除精氨酸外其他氨基酸含量都得到了显著的提高。经酸面团发酵后,MSB总游离氨基酸含量显著提升,增至244.92 mg/100 g。这可能是因为经过酸面团发酵后,在乳酸菌生长代谢作用下,绿豆酸面团中有机酸含量上升,激活发酵过程中蛋白酶的活性[29],使得面团中蛋白质降解更加充分,释放小肽成分和大量游离氨基酸,最终实现酸面团面包中游离氨基酸含量显著增加。Diana[29]等以添加蛋白酶的面团、乳酸菌酸面团和化学酸化面团为实验对象,对比研究发现三者中乳酸菌酸面团中游离氨基酸含量增加最为显著,证明乳酸菌发酵可显著增加酸面团中游离氨基酸含量。

WB和MB中GABA含量分别为4.38、4.87 mg/100 g,经产GABA乳酸菌(L.bu)发酵后的面包中GABA含量得到了显著的提升,MSB 中GABA含量达到23.44 mg/100 g。Inoue[30]等研究发现通过持续12周每日摄取100 mL含10～12 mg GABA的发酵乳可降低高血压患者的血压;Pouliot[31]等也发现摄入50 g含16 mg GABA的实验奶酪可起到降低人类高血压的作用。据此可推测若每日摄入100 g本研究所得到的富含GABA的功能性绿豆酸面团面包(23.44 mg/100 g)可对降血压起到一定的作用。

图3　小麦面包、绿豆面包及绿豆酸面团面包游离氨基酸及GABA含量Fig.3　Free amino acid content of WB,MB and MSB,including GABA注:小写字母不同表示差异显著(p<0.05),表2同。

2.4面包的比容和全质构

由表2可知,与小麦面包(WB)相比,绿豆面包(MB)比容较小,这可能是因为绿豆粉的存在降低了面筋蛋白含量,且其富含的膳食纤维不易被酵母利用,破坏了面筋网络结构,影响面团气孔稳定性,降低面包持气性[32],从而使面包比容下降。乳酸菌发酵后,有效地改善了绿豆面包(MB)比容,MSB的比容较MB提高了3.31%,小麦面包(WB)无显著性差异。这可能是因为乳酸菌的存在能够加速酵母的发酵,增加产气量,从而增大面包的比容[33]。Ketabi[34]等人也发现乳酸菌发酵酸面团可有效的提高面包比容。

全质构分析结果(表2)表明不同类别面包的回复性和内聚性无显著性差异,因此选择硬度、弹性、胶着性和咀嚼性评价面包的质构品质。其中,硬度、胶着性和咀嚼性与面包品质呈负相关,而弹性与面包品质呈正相关[35]。添加绿豆粉后,MB的硬度、胶着性和咀嚼性显著增加,可能是因为绿豆粉中膳食纤维含量较高,降低面团湿面筋含量、减少三维网络结构面筋蛋白,导致面团持气性下降,面包硬度增加、弹性下降。乳酸菌发酵酸面团后,使面包品质得到了一定的改善。MSB的硬度、胶着性和咀嚼性显著下降;弹性提高,全质构特性接近WB。由此可知,酸面团的使用有效地改善了绿豆粉所带来的质构上的弊端,提高了面包质构方面的品质。

2.5感官评定

感官评定结果与全质构测定结果相辅相成。WB外观饱满、完整,色泽黄亮均一,质地松软,富有弹性,质构均匀,不黏牙、不掉渣,因此,在除风味外其余各项均获得了较高的评分。绿豆粉自身所带的颜色使得绿豆面包表面色泽相对暗淡;绿豆粉的存在,降低整体面筋蛋白含量,影响面包质构、口感和持气性,从而使面包口感粗糙,质地较硬,内部气孔大小不均,易掉渣,且豆类植物特有的豆腥味使面包风味不愉悦,致使相较于其他类别的面包,MB在各项指标中均获得了最低的分数(图4),但仍大于6分,在消费者可接受范围内。

表2　小麦面包、绿豆面包及绿豆酸面团面包比容、全质构

图4　小麦面包、绿豆粉面包及绿豆酸面团面包感官评定Fig.4　Sensory evaluation of WB,MB and MSB

以MB作参照,L.bu发酵绿豆酸面团后在不同程度上增加了面包外观、色泽、风味、口感和整体可接受度的得分,MSB整体得分接近WB。乳酸菌发酵后,面包表面较为光滑,色泽均匀一致,故其感官得分显著提高;酸面团技术的应用降低了膳食纤维对面筋网络的破坏,使面包变软,质地均一,提高面包口感方面的得分;酸面团的引入使得MSB豆腥味变淡,且带有酸面团特有的风味,令人愉悦,因此其风味得分有所提升。总体而言,L.bu可有效的改善绿豆面包的感官特性,并得到消费者可接受的面包成品。

3　结论

传统发酵米粉中分离得到的乳酸菌经改良纸层析定性分析筛选得到1株具有产GABA能力的乳酸菌。经16S rRNA基因测序鉴定为布氏乳杆菌(Lactobacillusbuchneri)。高效液相色谱定量分析其GABA产量为3.66±0.05 g/L,检测结果与纸层析定性结果基本一致。

与小麦面包(4.38 mg/100 g)和绿豆面包(4.87 mg/100 g)相比,L.bu发酵的绿豆酸面团面包中GABA含量得到显著提高,增至23.44 mg/100 g,得到了富含GABA的功能性酸面团面包,进而使得通过摄入GABA功能性面包降低高血压病人的血压成为可能。除精氨酸外,绿豆酸面团面包中其余的17种氨基酸含量均显著高于小麦面包和绿豆面包。酸面团的引入显著提高了面包中总游离氨基酸含量,增强面包营养价值。

绿豆酸面团面包的比容、质构较绿豆面包有所提升,面包品质接近小麦面包,与之相对应的绿豆酸面团面包的各项感官指标评分也高于小麦面包。乳酸菌发酵酸面团带来的特有风味令人愉悦,使得其在风味指标方面得分尤为突出,受到消费者青睐。

综上所述,本研究获得了营养、感官特性较优的富含GABA的功能性酸面团面包,为利用高产GABA乳酸菌作为发酵剂生产富含GABA功能性发酵食品提供了一定的理论参考价值。

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Nutrition and baking properties of mung bean sourdough bread with highγ-aminobutyric acid

SU Xiao-qin1,ZHANG Ke-xin1,HUANG Wei-ning1,*,LIU Ruo-shi2,CHEN Jun-min2,ZHANG Luan2,LI Zhi-bin3,FU Gui-hua3,RAYAS-DUARTE Patrica4

(1.State Key Laboratory of Food Science and Technology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China;2.Nanjing Baihobake Biotechnology International Co. Ltd.,Nanjing 211000,China;3.Fujian Maidu Food Development Co.,Quanzhou 362213,China;4.Food and Agricultural Products Research Center,Oklahoma State University,Stillwater 74078-6055,USA)

In this study,the lactic acid bacteria(LAB)strain producingγ-aminobutyric acid(GABA)was isolated from traditional fermented rice noodles through primary screening and rescreening using modified paper chromatography(MPC)and HPLC,respectively. It was identified asLactobacillusbuchneri(L.bu)which was used in mung bean to enrich sourdough bread with GABA. Besides,the GABA production ofL.buin modified Man Rogosa Sharpe(mMRS)was 3.66±0.05 g/L. Compared with wheat bread and mung bean bread,the effects ofL.bufermentation on the nutrition and baking properties of mung bean sourdough bread were investigated. Results indicated that the total free amino acid content(244.92 mg/100 g)of mung bean sourdough bread(MSB)fermented byL.buwas 3.36 and 2.77 times of wheat bread(WB)and mung bean bread(MB),respectively. Meanwhile,the GABA content of MSB was 23.44 mg/100 g,which was significantly higher than that of mung bean bread and wheat bread. Moreover,the whole texture properties and the quality of MSB also has been significantly improved. Because of the addition of mung bean sourdough,the sensory characteristics score of MSB was significantly higher than the mung bean bread and it’s overall acceptability was close to wheat bread.

γ-aminobutyric acid(GABA);mung bean;lactic acid bacteria;sourdough;baking

2016-01-14

苏晓琴(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：烘焙科学、功能配料与食品添加剂，E-mail：qinxiaosu611@126.com。

黄卫宁(1963-)，男，博士，教授，研究方向：烘焙科学与发酵技术、谷物食品化学，E-mail：wnhuang@jiangnan.edu.cn。

江苏省产学研联合创新基金——前瞻性联合研究项目(BY2014023-16)；国家自然科学基金面上项目(31071595，31571877)；泉州市科技“燎原计划”项目(2015G46)；张家港市科技支撑计划项目(ZKN1301)；苏州市科技支撑计划项目(SNG201401)；中澳国际合作项目(201618)。

TS201.4

A

1002-0306(2016)13-0340-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.062