植物蛋白源抗氧化肽活性的评价方法及作用机制的研究进展

曹小舟,刘永祥,俞　凌,苏安祥,沈新春

(南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023)



植物蛋白源抗氧化肽活性的评价方法及作用机制的研究进展

曹小舟,刘永祥,俞凌,苏安祥,沈新春*

(南京财经大学食品科学与工程学院/江苏省现代粮食流通与安全协同创新中心/江苏高校粮油质量安全控制及深加工重点实验室,江苏南京 210023)

植物蛋白源天然抗氧化肽由于具有良好的抗氧化性和较高的安全性,因而受到国内外学者的广泛关注。本文综述了植物蛋白源抗氧化肽抗氧化活性的评价方法和作用机制,为进一步开发制备植物蛋白源抗氧化活性肽提供研究借鉴。

植物蛋白源肽,抗氧化活性,评价方法,作用机制

抗氧化肽是指动物或植物蛋白经过酶解和分离提取后得到,能够抑制生物大分子过氧化或清除体内自由基,具有一定抗氧化活性的肽段。与大分子的肽链蛋白质相比,它可以显示出更高的活性[1]。植物蛋白源抗氧化活性肽由于具有较强的抗氧化活性和较高的安全性,在抗氧化的基础上可以保持原有的营养和功能特性,而且在不同的条件下可以保持较稳定的活性。因此,在食品工业、饲料工业、化妆品工业和医药工业等众多领域都展现出较高的行业应用优势和广泛应用的潜在可能性,拥有非常广阔的开发前景[2]。适当的摄入抗氧化肽有助于清除机体过量的自由基,维持体内的自由基平衡,提高机体对于疾病的抵抗能力,帮助机体延缓衰老。人工合成的一些抗氧化剂如BHT、BHA、PG、TBHQ等,它们作为一种添加剂被应用于油脂及含油食品中,可以有效延缓或者阻止食品中蛋白质变性或者油脂酸败等,提高食品的稳定性,但其对人体的脾、肝、肺存在某些安全危害[3];天然抗氧化剂如生育酚由于成本过高而存在应用上的局限性。因此具有良好抗氧化性和较高安全性的植物蛋白源抗氧化肽是一个很好的选择。目前,国内外很多研究人员已从多种植物来源的蛋白质中提取出了具有清除自由基、亚铁离子螯合及抑制脂质过氧化等具有抗氧化活性的肽类物质[4-7]。它们能调整和改善人体的生理功能,达到预防和辅助治疗糖尿病、肥胖症和癌症等慢性疾病的目的[8-9]。本文主要就植物蛋白源抗氧化肽活性的评价方法及其抗氧化机制进行了系统的综述,以期为更好地评价和开发植物蛋白源抗氧化活性肽提供研究依据。

1　植物蛋白源肽的抗氧化活性评价方法

抗氧化肽的生产和来源方式主要分为以下三类:生物内源性抗氧化肽、人工合成的抗氧化肽和酶解蛋白质制备的抗氧化肽[10]。目前,制备抗氧化肽的方法主要有酸碱水解法、酶解法和发酵法[11],其中具有降解位点特异、快捷、可控、重复性高的酶解法[12]是最常用的方法。此外,酶解由于在比较温和的条件下进行,可以很好的保存氨基酸的营养价值。因此,酶解蛋白质制备抗氧化肽是目前抗氧化研究领域的一个热点。随着对抗氧化活性肽研究的不断深入,目前已经建立了多种评价抗氧化肽活性的方法。结合国内外学者对于各类植物蛋白质酶解产物以及多肽抗氧化性活性的研究,现有评价肽的抗氧化活性的常用方法主要有三类:体外化学法、细胞生物法、体内动物实验法。

1.1体外化学法

由于体外抗氧化活性测定方法操作简便、高效低毒、便于重复,该测定方法经常作为体内实验的前期研究被广泛使用。这种方法还可以分为两大类:基于氢原子转移(HAT)和电子转移(ET)的反应。

基于氢原子转移的抗氧化性活性测定方法主要是通过动力学曲线来定量分析其抗氧化能力,侧重于检测抗氧化剂通过提供氢原子从而捕获自由基的能力。反应机制为:X·+AH→ XH+A·。在亚油酸体系中的抗氧化能力、氧自由基吸收能力(ORAC)、总自由基捕获抗氧化参数(TRAP)等测定方法都属于此类方法[13]。

基于电子转移的抗氧化测定方法则是通过反应物颜色的变化来反应其抗氧化能力,侧重于检测抗氧化剂通过转移电子达到还原一些组分的能力,这些组分包括羧基、自由基、金属等[14]。反应机制为:X·+AH → X-+AH+·。常见的方法有测定还原能力、测定羟自由基、超氧阴离子自由基、ABTS自由基、DPPH自由基的清除能力[13]。

1.2细胞生物法

部分体外化学法测定肽的抗氧化性是在非生理温度和pH的条件下,然而生物体内的氧化过程极其复杂,因而导致在采用体外化学法评价抗氧化肽活性时,显示较高的抗氧化活性肽未必在生物体内也能取得良好的抗氧化效果。因此,所测定的抗氧化肽在生物体中的应用具有一定的局限性。细胞生物法可以提供吸收、新陈代谢等一系列生理功能的有效评价,已经成为目前研究生物活性肽的抗氧化活性和抗氧化机制的主流趋势。

Huang等[19]建立用H2O2诱导HepG2细胞氧化损伤模型,证实了甘薯蛋白SPD1可以通过减少HepG2细胞内过氧化氢的产生来发挥抗氧化活性;魏颖等[20]用油酸诱导的HepG2细胞模型评价玉米低聚肽对脂肪累积的影响,发现玉米低聚肽富含小肽段组分,对肝细胞的脂肪累积和抗氧化具有较好的预防保护作用;Zheng等[21]研究了脱脂花生粕蛋白对处于H2O2诱导下的PC12细胞的保护能力,研究发现花生粕蛋白能够提高细胞内谷胱甘肽过氧化物酶和超氧化物歧化酶的活性,并且能够抑制细胞内脂质的过氧化来发挥抗氧化作用,证明花生粕抗氧化肽可以提高细胞在过氧化氢条件下的存活率;Lu等[22]用DMEM培养基培养PC12细胞来测定抗氧化肽对处于过氧化氢环境下的PC12细胞的保护能力。研究发现:通过碱性蛋白酶酶解大麻籽抗氧化肽得到的抗氧化肽序列HVRETALV,与空白对照组相比,当其浓度为10 μg/mL时,细胞在过氧化氢环境下的存活率提高到了60%;梁盈等[23]通过H2O2诱导建立的HUVEC细胞氧化损伤模型,采用MTT和荧光显微镜观察,从细胞水平深入研究大米抗氧化活性肽,发现大米活性肽对H2O2损伤的HUVEC有一定的保护作用;樊金娟等[24]以大鼠红细胞为研究模型,证明了米糠抗氧化肽能抑制红细胞及肝组织自氧化产生的MDA和由H2O2诱导产生的MDA,抑制率为41%～60%;而且能够有效抑制血红蛋白氧化反应和红细胞溶血,抑制率为50% 左右,表明米糠抗氧化肽对大鼠红细胞和血红蛋白的氧化损伤具有保护作用;Garcia等[25]建立以H2O2和t-BOOH为氧化诱导剂的Caco-2细胞为模型,从细胞水平上研究了大豆抗氧化肽对氧化应激状态下细胞的保护作用,发现大豆肽主要通过清除过多的ROS来发挥对氧化损伤细胞的保护作用。

细胞生物法通过吸收、新陈代谢等一系列生理功能既可以方便的得出抗氧化肽的生物活性和利用性,又能研究其作用机制,很好的弥补了体外化学法的局限性;同时也可以弥补体内动物实验法成本高、耗时长的缺陷。但在相关的研究中,经常采用肿瘤细胞来构建细胞氧化损伤模型。由于肿瘤细胞内内源性的活性氧含量较高,可能会对实验结果造成一定的影响,不能真实反映活性肽的抗氧化机制。

1.3体内动物实验法

相比细胞生物法,体内动物实验法是建立在生理学、毒理学及病理学的基础上,采用生化技术对实验动物进行各项指标测试,测定结果可以更加准确有效的评价抗氧化肽在生物体内的抗氧化作用。因此,很多研究学者也通常采用这种评价方法来检验抗氧化肽对蛋白质和脂质的保护作用。大鼠或者小鼠常被作为实验的研究对象。通过建立有效的动物模型,测定血浆、脑、肝脏、心脏等组织的相关指标,如抗氧化酶(超氧化物歧化酶SOD、过氧化氢酶CAT、乳酸脱氢酶LDH、谷胱甘肽过氧化物酶GSH-Px等)的活性、脂质过氧化产物丙二醛MDA的含量,以进一步在生理代谢水平上验证和评价抗氧化肽的抗氧化能力。

王莉娟等[26]用D-半乳糖建立小鼠衰老模型,给予不同浓度的大豆抗氧化肽进行灌胃处理,考察了大豆抗氧化肽对实验小鼠脑指数、心指数、肝指数、脾指数、肾指数的变化。通过测定小鼠血清中MDA的含量,SOD的活力;小鼠脑、肝组织中MDA的含量,SOD、GSH-Px、CAT的活力,发现大豆抗氧化肽可以提高衰老小鼠血清中SOD活力、降低MDA含量;降低衰老小鼠肝、脑组织MDA含量;提高肝、脑组织SOD活力、GSH-Px、CAT活力。Yin等[27]发现用小麦抗氧化肽喂饲由非甾体抗炎药(NSAIDs)诱导的大鼠胃组织损伤和氧化应激模型时,能提高超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的活性,降低非甾体抗炎药诱发的胃上皮细胞变性、氧化应激和NO的水平。黄慧明等[28]采用注射溴代苯的方法诱导建立过氧化肝组织损伤小鼠模型,通过测定模型小鼠肝组织和血中的脂质过氧化物含量和过氧化物酶(超氧化物歧化酶和谷胱甘肽过氧化物酶)的活性来鉴定蚕丝蛋白肽的抗氧化功能。结果表明,蚕丝蛋白肽具有明显的抗氧化作用,其抗氧化作用途径之一就是提高抗氧化酶活力,降低脂质过氧化产物丙二醛的含量。朱艳华等[29]通过测定由FeSO4与H2O2诱导大鼠肝匀浆产生的MDA的含量,发现玉米抗氧化肽能抑制自由基诱导的大鼠肝线粒体肿胀,使大鼠肝线粒体肿胀度低于对照组,且剂量关系明显,表明其具有保护大鼠肝线粒体氧化损伤的作用。王才立等[30]通过D-半乳糖建立小白鼠氧化损伤模型,利用超滤和纳滤技术对通过复合酶法制备的小麦胚芽多肽进行分级分段和纯化后,得到的不同分子量的麦胚抗氧化肽进行体内抗氧化活性的评价,实验结果表明:小麦胚芽多肽能够使小鼠血清和肝脏中SOD、GSH-Px以及T-AOC的指标升高,降低小鼠血清和肝脏中脂质过氧化物的MDA含量,具有良好的抗氧化活性。总体来说,随着多肽质量浓度的升高,抗氧化活性也随之增强,分子量在2000 u以下的小麦胚芽多肽具有较强的抗氧化活性。

2　植物蛋白源肽抗氧化作用机制的研究

越来越多的研究表明,氧化应激在多种疾病的发生和发展中都扮演着重要的角色。抗氧化肽虽然对多种疾病显示出了一定的预防和辅助治疗作用,但其抗氧化机制还有待深入研究。随着人们对抗氧化活性肽研究的不断深入,阐明其抗氧化作用机制也成为了亟需解决的问题。从目前的研究结果来看,主要从以下几个方面对抗氧化肽发挥抗氧化作用的机制进行探讨。

2.1抑制自由基机制

生理代谢过程中所产生的自由基在机体内扮演着多种功能,如信号传导、预防感染等[31-33]。然而机体内过多的活性自由基反过来会导致正常的细胞组织出现损伤,引发动脉粥样硬化、糖尿病及癌症等多种疾病[34-35]。目前的研究普遍认为,抗氧化活性肽主要通过两条途径来清除自由基:一条是通过螯合金属离子来降低Fenton反应的速率,进而减少羟自由基的数量;另一条则是通过抗氧化活性肽的抽氢反应生成稳定的自由基,中断自由基的链式反应[36]。

Niranjan等[37]研究表明:当植物抗氧化肽的N端为疏水性氨基酸,比如缬氨酸(Val)或者亮氨酸(Leu),其抗氧化活性较高,可能是由于疏水性氨基酸的作用让抗氧化活性肽与脂肪酸之间的相互作用增强,导致抗氧化活性肽对自由基的捕捉能力增加。通过捕捉自由基反应链的过氧化自由基,阻止或减弱自由基链反应的进行。徐力[38]等通过碱性蛋白酶水解玉米蛋白得到的抗氧化肽序列Leu-Asp-Tyr-Glu,因为Tyr具有酚羟基结构,能提供质子猝灭自由基,与Tyr邻近的Asp和Glu的羧酸根具有吸电子作用,使Tyr酚羟基上氧电子云密度减弱,更有利于质子的释放,增强了Tyr的质子供体效应。此外,玉米抗氧化肽的N-端为疏水性氨基酸Leu,使抗氧化肽与脂肪酸的相互作用增强,提高了其对脂质自由基的捕捉能力。

Nrf2-Keap1信号通路是机体抗氧化的重要途径之一,Nrf2通过调节下游抗氧化酶基因的表达和GSH的合成清除机体中的自由基等活性氧,保证氧化还原系统平衡,防止DNA受到损伤[39-42]。郭钰洁等[43]用鹰嘴豆生物活性肽处理由H2O2诱导的Caco-2细胞和HT-29细胞,发现Nrf2-Keap1信号通路中的Nrf2及下游的抗氧化酶NQO1、HO-1 和γ-GCS的mRNA表达量增多,Nrf2、NQO1、HO-1和γ-GCS的蛋白表达量也增多。其抗氧化机理可能是鹰嘴豆生物活性肽引起Nrf2与Keap1发生解离,Nrf2进入到细胞核,与ARE的特异识别位点GCTGAGTCA进行结合,启动ARE调控的NQO1、HO-1和γ-GCS基因表达。NQO1表达量的增多可以维持内源抗氧化物的还原性;HO-1表达量增多能够产生更多的胆红素,而胆红素具有很强的抗氧化性;γ-GCS 能够促进GSH的产生。在这些抗氧化酶的作用下,氧化应激被抑制,多余的ROS得以清除,最终实现机体氧化还原状态的平衡。

2.2抑制抗氧化防御系统机制

在正常条件下,生物机体会不断的生成自由基,同时也存在着由内源性抗氧化剂(谷胱甘肽等)和抗氧化酶(超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物酶等)组成的防御系统,用于维持自由基的代谢平衡正常,使得机体内自由基的产生与清除处于动态平衡状态。然而,当内源性或外源性刺激促使机体内自由基产生过多导致抗氧化酶活性降低时,就会对DNA、RNA、蛋白质以及脂质等造成过氧化损伤引起细胞功能障碍[44]。通过在体外建立细胞氧化损伤模型,测定抗氧化活性肽对细胞中CAT、GSH-Px等酶含量的变化情况,可以明确抗氧化活性肽保护细胞可以免受自由基的氧化损伤的机制。Zhu等[45]建立由H2O2诱导的PC12细胞模型,发现麦胚抗氧化肽通过提高PC12细胞的存活率和细胞内CAT、SOD的水平,抑制线粒体膜电位的降低和细胞内Ca2+的积累,可以有效抑制由氧化应激造成的细胞损伤。范金波等[46]通过H2O2诱导人脐静脉内皮细胞损伤,发现:丝胶抗氧化肽通过提高细胞中总抗氧化能力、SOD、CAT 和GSH-Px酶水平以及细胞的NO水平;来发挥其对细胞免受损伤的保护作用,而且存在剂量依赖关系。

2.3抑制脂质过氧化机制

氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体的新陈代谢过程中扮演着极其重要的作用。在正常情况下,两者处于协调与动态平衡状态,维持着体内许多生理生化反应和免疫反应。但是,当这种协调与动态平衡产生紊乱或者失调时,就会引起脂质过氧化,形成脂质过氧化产物,如丙二醛(Malonaldehyde,MDA)和4-羟基壬烯酸(4-hydroxynonenal,HNE)等。抗氧化活性肽的抗氧化性可以通过测定脂质过氧化而得到体现[47]。抑制脂质过氧化的测定方法主要有硫代巴比妥酸法、共辄亚油酸体系测定法和电子自旋共振法[48-49],这三种方法均可用于检测活性肽是否可抑制脂质过氧化反应,从而进一步了解其抗氧化机制。Zhu[45]等发现小麦胚芽抗氧化肽能够通过降低过氧化氢诱导的PC12细胞内的MDA的作用,发挥其抗氧化作用。Xie[50]等建立小鼠肝损伤模型评价了决明子多肽的抗氧化活性,证明了其抗氧化机制与降低细胞内 MDA 的水平有关。林金莺[51]等以火麻仁种仁为原料,通过分步酶解和枯草芽孢杆菌液体发酵两种方法对火麻仁蛋白质进行了水解,最后采用飞行离子色谱鉴定得到了具有很明显抑制脂肪过氧化的能力的纯化酶解多肽:Phe-Leu-Lys-Leu-Thr-Ala-Glu-Arg和纯化发酵多肽:Arg-Ser-Arg-Lys-Gly-Phe-Glu-Trp-Leu-Arg-Val-Lys,其抗氧化机制主要是肽序列中的碱性氨基酸(赖氨酸和精氨酸)可与不饱和脂肪酸反应生成盐,从而可抑制不饱和脂肪酸的氧化反应的发生。

3　展望

目前,尽管国内外学者对于植物源抗氧化活性肽已经做了很多的研究,越来越多的抗氧化活性肽序列片段被分离鉴定出来,但仍然有很多问题亟需解决:一些已发现的抗氧化活性肽序列,其活性仅仅只在体外实验和细胞实验中被证实,还缺乏通过动物模型进一步从机体内进行更加深入的研究,在分子营养学水平上明确抗氧化肽在体内的抗氧化作用机制,例如,通过哪种信号通道发挥其抗氧化作用等更深层次的作用机制;抗氧化肽的分离制备技术由于成本高、耗时耗力、而且蛋白回收率不高等缺点在一定程度上阻碍了抗氧化肽的商品化进程,探索新型快速并能大规模从植物源蛋白中制备抗氧化活性肽的方法迫在眉睫;针对新发现的抗氧化活性肽序列,还未能进一步进行构效关系和分子修饰等方面的研究;抗氧化肽作为功能性食品或药品,最终都要通过摄入体内发挥其功效。从体外筛选出的抗氧化活性肽还需研究在消化过程中的降解规律以及其胃肠稳定性是否遭到破坏。随着研究的深入和生物技术的快速发展,这些问题都会被一一解决,从而为抗氧化活性肽的应用打开更加广阔的空间。

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Progress in evaluation methods and action mechanism of antioxidant activity for plant protein-derived peptides

CAO Xiao-zhou,LIU Yong-xiang,YU Ling,SU An-xiang,SHEN Xin-chun*

(College of Food Science and Engineering/Collaborative Innovation Center for Modern Grain Circulation and Safety/Key Laboratory of Grains and Oils Quality Control and Processing,Nanjing University of Finance and Economics,Nanjing 210023,China)

Natural,safe,and efficient antioxidant peptides derived from many plant proteins have received much attentions from researchers at home and abroad. The evaluation methods and the molecular mechanism of antioxidant activity for plant protein-derived peptides were summarized in the present review,which will shed some lights on the further development and utilization of antioxidant peptides derived from plant proteins.

plant protein-derived peptides;antioxidant activity;evaluation methods;mechanism

2015-12-16

曹小舟(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：农产品深加工与副产品综合利用，E-mail：15951912672@163.com。

沈新春(1966-)，男，博士，教授，研究方向：农产品深加工与副产品综合利用、分子营养，E-mail：shenxinchun@njue.edu.cn。

国家自然科学基金项目(31271983)；江苏省自然科学基金(BK20141484)；江苏省高校自然科学研究重大项目(14KJA550002)；2015年度江苏省高校优秀科技创新团队；江苏高校优势学科建设工程资助项目。

TS210.9

A

1002-0306(2016)13-0355-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.065