海洋动物源性糖蛋白研究进展

于志鹏,武思佳,赵文竹,*,郭　辉，丁　龙,励建荣,*,刘静波

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062)



海洋动物源性糖蛋白研究进展

于志鹏1,武思佳1,赵文竹1,*,郭辉1，丁龙2,励建荣1,*,刘静波2

(1.渤海大学食品科学与工程学院,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.吉林大学营养与功能食品研究室,吉林长春 130062)

糖蛋白是寡糖链与多肽以多种形式共价相连且具有生物活性的物质,天然糖蛋白具有抗氧化、抗肿瘤、提高免疫力等生理活性。本文对海洋动物源性糖蛋白的组成结构、功能特性、制备以及分离纯化等方面的研究现状进行综述,并分析展望了海洋动物源性糖蛋白的未来研究前景,旨在为海洋动物源糖蛋白的基础研究与应用提供理论参考。

糖蛋白,提取,分离纯化,结构

糖蛋白是一种由多糖和蛋白质构成的活性组分,20世纪初美国生物化学协会蛋白质命名委员会首次将其定义为由蛋白质分子和除核酸外含有碳水化合物基团物质共同组成的一类复合物。糖蛋白广泛存在于生物体内,研究发现食物本身具有或通过体外水解方式获得的糖蛋白有着抗氧化、抗肿瘤、增强免疫力等生理功能[1-2]。随着糖生物学、糖组学、现代分离纯化技术和鉴定技术的发展,糖蛋白的提取[3-4]、纯化[5-6]、结构鉴定[7-8]和活性评价[9]等研究现已成为诸多学科研究人员关注的焦点。近年来,随着国内外研究学者对海洋资源开发利用的重视,源于海洋动物的糖蛋白研究逐渐成为热点。本文就海洋动物源性糖蛋白的发展现状进展进行了综述,旨在为糖蛋白的深入研究提供理论参考。

1　海洋动物源性糖蛋白的组成及结构

糖蛋白是蛋白质以共价键方式与糖分子链相连所构成的分子,主链较短且一般情况下糖含量小于蛋白质含量,因此糖蛋白总体性质更接近于蛋白质。糖蛋白中的肽链几乎含有所有的氨基酸种类,其中苏氨酸、丝氨酸、羟脯氨酸、天冬酰胺、羟赖氨酸等含量较高。糖蛋白糖链中单糖则包括L-阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、甘露糖、木糖、L-岩藻糖、半乳糖胺、唾液酸和L-艾杜糖醛等。糖链的存在可提高糖蛋白的亲水性,且可与其他糖链或蛋白质形成共价键或氢键,起到结构支架或转移糖基的作用[10]。糖基化在细胞免疫、信号传导、蛋白翻译调控、蛋白降解等诸多生物过程中起着重要作用。目前糖基化反应是一种绿色的蛋白质改性方法,可改善蛋白质的功能特性,因此糖基化研究也愈益受到广泛关注[11-12]。

糖肽键是糖链和肽链的连接键,是由糖基异头碳原子上的羟基与肽链氨基酸残基上的酰胺基或羟基脱水形成的糖苷键。糖肽键可分为N-糖肽键和O-糖肽键两大类[13-14](图1),主要包括木糖-丝氨酸型、半乳糖-羟赖氨酸型、阿拉伯糖-羟脯氨酸型、半乳糖-羟脯氨酸型、半乳糖-丝氨酸型、半乳糖-半胱胺酸型、葡萄糖-半胱氨酸型、甘露糖-丝(苏)氨酸型、岩藻酸-苏氨酸型8种连接方式。 糖肽键类型的判断可通过β-消除反应来进行。

图1　O-糖肽键(a)和 N-糖肽键(b)[14]Fig.1　O-glycopeptide linkage(a) and N-glycopeptide linkage(b)[14]

2012年陈觉等[15]首次报道了P-糖蛋白的晶体结构(图2),P-糖蛋白是具有两个同源亚单位的单链多肽,每个亚单位包含有跨膜结构域(TMD)和胞质核苷酸结合结构域(NBD)(图2a),并表现出类似的内向型结构,并且在两个NBDS之间有较大程度的间隔(图2b),且向细胞膜内层侧向开口的TM10和TM12螺旋是不连续的(图2c)。P-糖蛋白是一种在癌细胞中赋予多药耐药的ATP结合盒转运载体蛋白(ATP-binding cassette transporter,ABC),影响癌症无关药物和异生物质的吸收、分布和清除。

图2　P-糖蛋白的晶体结构(分辨率为3.4埃)Fig.2　Crystal structure of the multidrugtransporter P-glycoprotein

目前糖蛋白的结构鉴定方法有甲基化分析、高碘酸氧化、IR、13C-NMP、GC-MS、X-衍射等,主要涉及分子量测定、氨基酸及单糖组成测定、糖肽键特征分析等。糖蛋白分子量的测定主要通过SDS-聚丙酰胺凝胶电泳法、质谱扫描或沉降速度法等。研究糖链组成结构时需要对单糖组成、异头构型、糖的环状构象、糖链连接顺序、各糖间的连接位置、连接构象、非糖基取代物的位置及高级结构等进行分析[16],常用方法有高碘酸氧化法、甲基化法、稀碱水解、肼解反应、IR、HPLC、GC-MS、FAC-MS、HPAEC-PAD、ESI-MS、SDS-PAGE、MALDI-MS及RAAM 等联用、MALDA-MS与O-TOF联用、FTICR与质谱联用等[17-18]。目前,糖蛋白组学技术也逐步应用于海洋动物源性糖蛋白的结构鉴定。

2　海洋动物源性糖蛋白的功能活性

2.1抗氧化

黄来珍等[19]研究发现近江牡蛎3种糖蛋白粗提物均具有一定的清除羟自由基、DPPH自由基和超氧阴离子自由基的能力,且这3种糖蛋白对羟自由基的清除能力高于对DPPH自由基和超氧阴离子自由基作用效果。任国艳等[20]利用磷酸缓冲溶液(pH7.2)浸提海蜇糖蛋白,并通过化学发光法测定了糖蛋白组分JF-Ⅲ对羟基自由基和超氧自由基的清除效果,结果表明JF-Ⅲ有较强的自由基清除活性。戴宏杰[21]通过测定虎斑乌贼肌肉糖蛋白(SPMG)的还原力及对超氧阴离子自由基、羟自由基和过氧化氢的清除能力,发现SPMG具有一定的抗氧化活性。

2.2抗肿瘤

刘倩等[22]研究尖紫蛤全脏器中糖蛋白对鼻咽癌CNE-2Z有抑制作用。顾谦群等[23]发现栉孔扇贝中提取的糖蛋白(FGP)具有显著的肿瘤抑制作用,这种作用可能通过增强小鼠细胞免疫功能而实现。祝雯等[24]提取的河蚬蛋白 CFp-a对BEL7407癌细胞生长有抑制作用。管角螺肌肉经盐水浸提后得到管角螺糖蛋白(AGHⅠ、AGH Ⅱ、AGH Ⅲ和NGH)的粗提物,经初步药理实验证明NGH对小鼠S180具有抑制作用[25]。

2.3免疫调节

章建设等[18]从鱿鱼中提取的糖蛋白具有一定的免疫活性,能使小鼠体内单核巨噬细胞的吞噬能力增强,从而提高小鼠的免疫力。Lei等[26]在章鱼干中,经盐提得到的O GP1,O GP2和O GP3糖蛋白具有促进T细胞与小鼠脾细胞增殖的作用。任国艳等[27]以海蜇头为原料,通过缓冲液提取,95%乙醇分级沉淀、Sephacryl S300HR柱层析等分离纯化方法,获得JGP-Ⅱ、JGP-Ⅲ、JGP-Ⅳ三种糖蛋白,并通过测定淋巴细胞增殖反应实验得出3种糖蛋白在一定程度上可促进淋巴细胞转化,增加免疫活性。

2.4其他生物活性

王珊珊等[28]从鲫鱼卵中提取的唾液酸糖蛋白具有抑制破骨细胞增殖分化的功能,能显著调节骨质疏松症大鼠骨代谢,抑制高骨转换速率,防止骨丢失。林丹等[29]从霞水母中提取的糖蛋白具有增加机体肝糖原的储备、减少血清尿素氮产生、加快运动后血乳酸水平的恢复的作用,有明显抗疲劳活性。

3　海洋动物源性糖蛋白的制备

糖蛋白在生物体内以不同形式存在且参与凝血、免疫、分泌、内吞、物质转运、信息传递、神经传导、细胞迁移、创伤修复等生理活动。其存在广泛且有极高的利用价值,已有研究表明从牡蛎、鱿鱼、鲫鱼、珠母贝等海洋动物中制备的糖蛋白具有调节免疫、抗肿瘤、抗炎、降血糖、降血脂、抗氧化、防衰老等功效[19,30]。糖蛋白是寡糖链与多肽链以多种共价相连的复合糖,兼有糖和蛋白质的性质,其制备方法主要采用水提法、盐提法、醇提取法等[1]。因蛋白质和糖种类多且性质差异多样化,在不同体系中的提取方式也存在着差异。

表2　稀盐溶液浸提法提取糖蛋白

3.1水浸提法

糖蛋白中糖链的高度亲水性使其易溶于水,因此可用水浸提法进行提取,提取条件也因糖蛋白的结构质差异而不同(表1),从而实现最大限度的溶出糖蛋白且不破坏糖蛋白的稳定性。糖蛋白提取剂一般以水溶液为主,通常根据原料特性需要先进行脱脂和脱色处理后再进行提取,得率一般在0.98%～1.68%[30-31]。

表1　水浸提法提取糖蛋白

3.2稀盐溶液或缓冲盐浸提法

糖蛋白在稀盐和缓冲溶液中稳定性好且溶解度大,因此可作为常用的提取溶剂,其中氯化钠溶液和磷酸盐缓冲溶液最为常用。稀盐溶液或缓冲盐溶液因其中盐离子与蛋白质部分结合具有保护蛋白质使其不易变性的特点。一般能溶解在水溶液中而且与细胞颗粒结合不太紧密的糖蛋白,选用适当的盐浓度及pH条件进行提取,可有效提高其提取效果(表2),得率一般在1.8%～9.3%[32-37]。提取率一般在6.25%～12.79%[38-39]。

3.3酸碱提取法

蛋白质是两性电解质,碱性和酸性蛋白质可分别用偏酸性和偏碱性提取液提取,NaOH和HCl溶液为常用酸碱提取的糖蛋白溶液。用稀酸或稀碱溶液进行提取时,要注意防止过酸或过碱导致蛋白质构象的不可逆变化。王倩[38]等以鱿鱼缠卵腺为原料提取糖蛋白,对NaOH浓度、提取温度和提取时间等因素进行单因素实验,并通过建立回归模型及显著性检验确定了显著因素,最终得出从鱿鱼缠卵腺中提取糖蛋白的最佳工艺条件为:提取时间3.5 h,提取温度25 ℃,NaOH浓度0.37 mol/L,在此条件下糖蛋白得率为12.79%。王倩等[42]以太平洋褶柔鱼缠卵腺为原料,通过水溶液浸提、酶解法提取和碱溶液提取这三种方式提取糖蛋白,对比发现碱溶液提取法效果最佳,其工艺参数为:提取时间3.44 h,提取温度25 ℃,NaOH浓度为0.37 mol/L,此条件下不仅可提高糖蛋白的提取率,且醇沉时消耗乙醇量少。

3.4酶解提取法

酶解法提取糖蛋白可有效减少有效成分溶出及溶剂提取时的传质阻力,在缩短提取时间的同时提升提取效率,并利用酶的专一性和高选择性避免提取过程中对底物其他成分的破坏。目前采用酶解法提取糖蛋白的报道较少。范秀萍[39]以海蜇皮为原料制备糖蛋白,通过选择酶用量、料水比、酶解温度与时间四个因素设计正交实验,分别讨论枯草杆菌中性蛋白酶与胰蛋白酶对糖蛋白提取的影响,得出当使用枯草中性蛋白酶/胰蛋白酶复合酶解法提取的最佳工艺条件分别为:料液比1∶0.5、温度50 ℃、酶用量(枯草中性蛋白酶/胰蛋白酶)0.2%/0.3%、时间3 h/4 h。方旭波等[43]采用酶解法,经酶解、75%乙醇沉淀和丙酮乙醇洗涤,最终得到鱿鱼硫酸软骨素糖蛋白。酶解法以其反应条件温和、特异性强和提取率高等优点,具有较大的应用前景。

表3　超声辅助提取糖蛋白

3.5超声辅助提取法

超声波在传递的过程中会产生振动、传递出能量,使物料细胞壁被破坏或细胞发生形变、温度升高,从而加速糖蛋白的溶解,缩短时间、提高提取效率和增加得率;同时超声波辅助提取所需温度较低,避免了高温对热敏性物质的破坏。由于糖蛋白种类繁多,性质上差异比较大,即使是同类糖蛋白,但因其处于不同体系,因此提取条件也存在差异,在糖蛋白的超声辅助提取过程中时常综合考虑这些内外因素(表3)。

4　海洋动物源性糖蛋白的分离纯化

糖蛋白的分离纯化是指从糖蛋白粗品中分离出单一组分糖蛋白的过程,是对糖蛋白进行结构鉴定的基础。主要是通过生化分离的手段,先将杂质去除后再进行逐级分离,从而得到具有一定纯度的目标糖蛋白。糖蛋白的初步分级可利用硫酸铵分级沉淀、乙醇或乙二醇沉淀法,初步分级的糖蛋白可经离子交换色谱等进一步分离纯化。由于食源性糖蛋白的来源广泛,形式复杂,且不同的糖蛋白间存在着相似性,因此对其的分离纯化要根据糖蛋白的具体性质与实验目的进行选择。

4.1离子交换层析法

离子交换层析法根据物质的酸碱性、极性等差异,通过离子间的吸附和脱吸附原理将电解质溶液的各组分分开。操作中需先将含各种糖蛋白的粗品吸附于层析柱,然后用不同的洗脱液将与层析介质结合力不同的糖蛋白分别洗脱下来而达到分离纯化的目的。利用离子交换层析纯化时要根据糖蛋白的结构性质进行选择,一般分离糖蛋白常用阴离子交换柱,此法适用于分离各种酸性、中性或碱性的糖蛋白。吴红棉等[41]将菲律宾蛤仔糖蛋白粗品(CGP)使用DEAE-52纤维素进行分离纯化,首先用蒸馏水洗脱得到一中性组分NGP;经2.0 mol/L NaCl梯度洗脱后得到AGP-I、AGP-II、AGP-III3个酸性组分;而后再将NGP和AGP-Ⅲ经Sephadex G-100凝胶柱进一步分离纯化。夏光华等[47]以鲫鱼卵为原料提取水溶性蛋白,将提取得到的粗糖蛋白经QFF阴离子交换纯化,采用0～1 mol/L的NaCl进行梯度洗脱,而后采用S-200凝胶柱进一步分离纯化,再经G-25凝胶柱脱盐后冻干,得到可促进MC3T3-E1细胞增殖、分化和矿化的的CA-SGP组分。

4.2凝胶柱层析法

凝胶层析法分离糖蛋白是将粗糖蛋白加入充满凝胶颗粒的层析柱中,后用缓冲液洗脱,由于糖蛋白分子的大小和形状不同,从而得到分离。常用的凝胶有葡聚糖凝胶和羟丙基葡聚糖凝胶,其中葡聚糖凝胶只适用在水中,羟丙基葡聚糖凝胶不仅可在水中应用,也可在极性有机溶剂或与水组成的混合溶剂中使用,因此应根据提取方法的不同,选择不同的凝胶进行纯化。汪秋宽等[48]将经透析后的牡蛎粗糖蛋白经DEAE-52柱(2.6 cm×22.5 cm)分离纯化,经磷酸盐缓冲液(pH7.2)洗脱,收集液经冷冻浓缩后用Sephadex G-200分离得到糖蛋白G I和GⅡ组分。

4.3亲和层析法

亲和层析法是制备糖蛋白的一种有效方法,主要根据生物大分子的生物学特异性(即专一性亲和力),利用凝集素能专一且可逆地与游离或复合糖类中的单糖或寡糖结合的性质,可采用固定化凝集素亲和层析来分离纯化糖蛋白[49]。祝雯等[24]将河蚬糖蛋白经Blue Sepharose 6 Fast Flaw亲和层析,用Tris-HCl洗脱至A280<0.02,用含0.05 mol/L NaCl的Tris-HCl洗脱(流速1 mL/min),收集洗脱液浓缩后用PBS平衡;再经SP Sepharose Fast Flaw(1.7 cm×15 cm)柱层析,用PBS洗脱至A280<0.02,用含0～0.5 mol/L NaCl的PBS梯度洗脱(流速40 mL/h),收集液再经HPLC柱层析分离纯化得到糖蛋白CFP-a。

此外,根据糖蛋白糖链部分特殊理化性质,纳米离子以其丰富的活性亲和位点[50]和特殊结构已开始逐步应用于糖蛋白的分离与富集[51],还有凝集素亲和法、硼酸法、肼化学反应法和免疫法等也有应用。

5　展望

糖蛋白对人类健康作用已被证实,目前可以利用其免疫原性和免疫反应性,将细菌的多糖抗原与蛋白载体通过化学方法制备多糖蛋白结合疫苗。由于糖基化修饰与疾病的密切关系,利用糖蛋白及糖链作为疾病诊断标志物和治疗靶标的研究成为了研究热点,同时也将有更多的生物活性功能被逐渐发现。海洋动物资源丰富,对海洋动物源性糖蛋白的研究将对未来食品、保健品乃至药品的开发有巨大借鉴意义,市场潜力和开发前景广阔。

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Research progress of glycoprotein from marine animal

YU Zhi-peng1,WU Si-Jia1,ZHAO Wen-zhu1,*,GUO Hui1,DING Long2,LI Jian-rong1,*,LIU Jing-bo2

(1.College of food science and engineering,Bohai University,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.Lab of Nutrition and Functional Food,Jilin University,Changchun 130062,China)

Glycoprotein is a kind of bioactive substance,which is constructed with oligosaccharide chains and peptides by a variety of covalent forms. Natural glycoprotein exhibits physiological activities,such as anti-oxidation,anti-tumor,and enhance immunity. The current work reviewed the research progress of the glycoprotein from marine animals,including the structure,function,preparation and purification of the glycoprotein. Furthermore,the further study of marine animal-derived glycoprotein was addressed,aimed to provide the reference for the development of the glycoprotein.

glycoprotein;extraction;separation and purification;structure

2015-12-04

于志鹏(1984-)，男，博士，讲师，研究方向：蛋白质及活性肽的功能研究与产品开发,E-mail：yuzhipeng20086@sina.com。

赵文竹(1986-)，女，博士，讲师，研究方向：营养与功能食品，E-mail：zhaowenzhu777@163.com。

励建荣(1964-)，男，博士，教授，研究方向：水产品加工，E-mail：lijr6491@163.com。

国家科技支撑课题(2012BAD00B03)；辽宁省科技攻关项目(2015103020)。

TS201.1

A

1002-0306(2016)13-0376-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.13.069