刺槐素的不同给药时间对小鼠局灶性脑缺血的影响

补娟　赵宗峰　王慧琴　张晓玲　张艳君　吴卫东



刺槐素的不同给药时间对小鼠局灶性脑缺血的影响

补娟赵宗峰王慧琴张晓玲张艳君吴卫东

目的探讨刺槐素在不同时间点给药对小鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用，并分析刺槐素的治疗时间窗。方法将36只雄性昆明小鼠随机分为假手术组、缺血再灌注组、刺槐素(治疗)组，治疗组又根据不同给药时间分为0、2、4、8 h 4个给药组，每组各6只；采用线栓法制作大脑中动脉闭塞模型，治疗组予缺血0、2 、4、8 h腹腔注射刺槐素(12.5 mg/kg)；再灌注后24 h进行神经功能评分，应用2,3,5-氯化三苯基四氮唑染色测定脑梗死体积。结果缺血0、2、4 h给药组神经功能评分均显著低于缺血再灌注组(p均<0.05)，8 h给药组神经功能评分有改善，但无统计学意义(p=0.052)；不同时间给药组间神经功能评分无统计学意义(p>0.5)。缺血再灌注组脑梗死体积为(65.18±5.96)mm3,与缺血再灌注组相比，缺血0 h[(22.15±3.02)mm3，p=0.000]，2 h[(28.61±4.19)mm3，p=0.000]，4 h[(49.8±4.08)mm3，p=0.000]给药组脑梗死体积均显著降低，8 h[(56.09±7.92)mm3，p=0.075]给药组脑梗死体积有减小，但无统计学意义。结论在缺血早期应用刺槐素治疗可有效改善神经功能评分，缩小脑梗死体积。

刺槐素脑缺血再灌注疾病模型动物小鼠

脑卒中(stroke)包括缺血性脑卒中和出血性脑卒中，其中约78%的脑卒中为缺血性卒中(ischemia stroke)，其具有较高发病率、较高病死率和较高致残率的特点[1]。近年来虽然脑卒中的病理机制研究取得较大进展，但向临床应用的有效转化均未成功。脑卒中尚缺乏理想有效的治疗药物，组织纤维蛋白酶原激活剂(tissueplasminogen activator, tPA)依然是当前治疗缺血性脑卒中的主要药物。但是，tPA严格的有效治疗时间窗及其不良反应等原因极大地限制了其在临床的应用。因此，深入研究该病的发病机制、寻找有效的生物靶点、研发安全有效的治疗药物治疗缺血性脑血管病具有重大的意义。

刺槐素(Acacetin)又称刺槐黄素、金合欢素，属黄酮类化合物，可从菊花、刺槐、雪莲等多种植物中提取获得[2-4]，其具有抗氧化作用和抗炎作用。目前，关于刺槐素的研究较少，主要集中在抗肿瘤作用的研究，最近的研究发现刺槐素对神经炎症性疾病发挥神经保护作用。Sang Keun Ha[5]等发现刺槐素可抑制小胶质细胞的活化，抑制炎性因子的表达，从而对神经炎症反应发挥保护作用。小胶质细胞介导的炎症反应是脑缺血再灌注损伤的重要机制，因此推测刺槐素对脑缺血再灌注损伤具有保护作用。课题组前期应用氧-葡萄糖剥夺模型和局灶性脑缺血模型来探讨不同剂量的刺槐素对脑缺血再灌注损伤的保护作用，体内外结果均证明刺槐素具有保护作用[6]。有效治疗时间窗是许多神经保护药物临床转化失败的原因之一，关于刺槐素的有效治疗时间窗尚不明确。本研究通过建立小鼠局灶性脑缺血模型，在缺血后不同时间点给予刺槐素治疗，观察再灌注24 h后小鼠脑神经功能评分和脑梗死体积，明确刺槐素对脑缺血再灌注损伤的有效治疗时间窗。

1　材料与方法

1.1实验动物及分组

清洁级雄性昆明小鼠，体重(25±2)g，由新疆实验动物研究中心提供(许可证号：SCXK(新)2011-0001)。用随机数字法将小鼠分为假手术组、缺血再灌注组、刺槐素(治疗)组，刺槐素(治疗)组根据不同给药时间分为缺血0、2、4、8 h 4个给药组。假手术组仅分离颈内动脉，但不闭塞大脑中动脉，缺血时给予等体积刺槐素处理；缺血再灌注组缺血时腹腔注射等体积1%DMSO；治疗组予设定时间点腹腔注射等体积刺槐素(药物浓度统一为12.5 mg/kg，美国Sigma公司，溶于1%DMSO溶液)。

1.2小鼠MCAO动物模型的建立

实验环境中适应3 d，自由饮水。采用改良线栓法制作小鼠大脑中动脉栓塞模型[7]。腹腔注射1．5%的戊巴比妥钠(德国进口分装，北京化学试剂公司) 麻醉小鼠，仰卧位固定齿及四肢；行颈部正中纵行切口(5～6 mm)，依次钝性分离及暴露右侧颈总动脉、右侧颈外动脉；暂时夹闭颈总动脉，结扎并凝断颈外动脉远心端，于颈外动脉残端插入直径0.22 mm的硅胶线栓(6023PK,Doccol Corp, CA, USA)至大脑中动脉；阻断血流60 min后缓慢拔出线栓恢复血流再灌注。术中至小鼠苏醒前维持体温在37 ℃左右。

1.3神经功能评分

再灌注24 h后各组小鼠按照Longa[8]等的方法进行神经功能评分，评分标准为0分：无神经功能损伤症状或体征；1分：缺血对侧前肢内收；2分：行走时向瘫痪侧转圈；3分：行走时向瘫痪侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失或死亡。1～3分为模型成功，0、4分及出现癫痫发作、取材时发现脑出血者均予剔除并随机补充，保证每组小鼠数不变。

1.4脑梗死体积测定

缺血/再灌注24 h后处死小鼠，迅速断头取脑组织，放于-20 ℃冰箱快速冷冻按1 mm厚冠状位切片，将切片放入1.5% TTC(美国Sigma公司)磷酸盐缓冲液中，37 ℃恒温箱孵育染色20 min，正常脑组织染成红色，梗死灶为白色，然后将脑组织取出置于4%多聚甲醛(美国Gibco公司)中固定2 h；采用 Image pro plus6.0软件测量各区面积，计算梗死灶体积为V=Σ(S1+S2) ·d/2。公式中V为总体积；S1和S2分别表示切片头侧和尾侧面积；d为切片厚度。

1.5统计学分析

2　结　果

2.1刺槐素不同给药时间对缺血再灌注损伤小鼠行为学评分的影响

再灌注后24 h缺血再灌注组和刺槐素不同时间给药组均出现神经功能缺损，表现为左侧肢体不同程度活动障碍、向左侧转圈等。与缺血再灌注组[(2.83±0.41)分]相比，缺血0 h给药组[(1.5±0.55)分，P=0．004]、缺血2 h 给药组[(1.67±0.52)分，P=0．016]、缺血4 h给药组[(1.67±0.82)分，P=0．016]神经功能评分均显著改善。缺血8 h给药组[(1.83±0.75)分，P=0．052]神经功能有改善，但无统计学意义。不同时间给药组间神经功能评分无统计学意义(p>0.5)(表1)。

表1　各组小鼠神经功能缺损评分比较±s,分)

注：与缺血再灌注组比较，*P<0.05

2.2刺槐素不同给药时间对缺血再灌注损伤小鼠脑梗死体积的影响

缺血再灌注组脑梗死体积为[(65.18±5.96)mm3],与缺血再灌注组相比，缺血0 h[(22.15±3.02)mm3，p=0.000]，2 h[(28.61±4.19)mm3，p=0.000]，4 h[(49.8±4.08)mm3，p=0.000]给药组脑梗死体积均显著降低，8 h[(56.09±7.92)mm3，p=0.075]给药组脑梗死体积有减小，但无统计学意义(图1、表2)。

图1各组小鼠脑梗死体积比较

表2　各组小鼠脑梗死体积比较，mm3)

注：与缺血再灌注组比较，*P<0.01

3　讨　论

缺血性脑卒中病理生理机制复杂，目前的治疗方法主要有溶栓治疗和神经保护治疗。以组织纤维蛋白溶酶原激活剂为代表的溶栓治疗，由于过窄的时间治疗窗和出血等严重的并发症，并不能广泛地应用于临床。另一种神经保护治疗方法旨在干预细胞缺血级联反应，挽救缺血半暗带区域尚有活力神经组织，改善临床神经功能预后[9]。多年来，人们研究了上千种神经保护药物，但临床转化均为失败。仅有日本三菱制药研发的自由基清除剂依达拉奉(MCI-186)2001年 4 月在日本被批准上市，但是依达拉奉的神经保护功效尚未得到主流学术界的认可[10]。因此，继续寻找新的、安全有效的药物仍是神经保护领域的热点。

学者在寻找新的神经保护药物的同时，也在审视以往基础实验和临床试验中的不足，发现大多数人们都重视复杂的机制研究，而缺乏系统的临床前研究，如给药方式、药物的量效关系、药物的治疗时间窗、性别、年龄对药物效果的影响等。前期我们研究了刺槐素的剂量效应，但刺槐素的有效时间窗尚不明确。本研究采用单次给药方式，给药时间分别设定在缺血开始后 0、2、4、8 h，并在缺血24 h后进行神经功能评分和脑梗死体积测定，结果显示刺槐素具有良好的治疗时间窗，在缺血4 h给药仍能有效地改善神经功能评分，减少脑梗死体积；在缺血8 h给药神经功能评分和脑梗死体积仍有减少趋势。啮齿类动物脑缺血模型中所展示的治疗时间窗在一定程度上能够预示药物在人体上的时间窗[11]。刺槐素4h的有效治疗时间窗已接近临床实际应用的时间窗，揭示刺槐素可作为一种潜在的神经保护药物。

本研究仅探讨了刺槐素对脑缺血再灌注损伤的时间窗问题，以后将进一步探讨应用局灶性脑缺血模型，刺槐素对不同性别和年龄小鼠的治疗效果以及刺槐素发挥神经保护作用的机制研究。

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[2]Uehara A,Nakata M,Kitajima J,et al.Internal and external flavonoids from the leaves of Japanese Chrysanthemum species (Asteraceae)[J].Biochem Syst Ecol,2012,41(1):142-149.

[3]Nigel C,Peter C,Geoffrey C,et al.Flavonoid glycosides of the black locust tree,Robinia pseudoacacia(Leguminosae)[J].Phytochemistry,2010,71(4):479-486.

[4]Li GR,Wang HB,Qin GW,et al.Acacetin, a natural flavone, selectively inhibits human atrial repolarization Potassium currents and prevents atrial fibrillation in dogs[J].Circulation,2008,117(19):2449-2457.

[5]Ha SK,Moon E,Lee P,et al.Acacetin attenuates neuroinflammation via regulation the response to LPS stimuli in vitro and in vivo[Z],2012:24.

[6]补娟.朱沂,胡刚等.刺槐素在SH-SY5Y细胞氧一葡萄糖剥夺和小鼠脑缺血再灌注中的神经保护作用[J].国际脑血管病杂志,2013,21(1):47-50.

[7]Uluc K MA,Baskaya MK.Focal cerebral ischemia model by endovascular suture occlusion of the middle cerebral artery in the rat[Z],2011.

[8]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84-91.

[9]叶瑞东.人参皂苷Rd治疗急性缺血性脑卒中的临床前研究[D].西安:第四军医大学,2012.

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(2016-04-12收稿)

Time dependent effect of acacetin on ischemia and reperfusion injury in mice

BuJuan,ZhaoZongfeng,WangHuiqin,etal.

People'sHospitalofXinjiangUygurAutonomousRegion,Urumqi830001

ObjectiveTo investigate the neuroprotective effects of Acacetin in Mice after cerebral ischemia and reperfusion when it was administered at different time points and analyze acacetin therapeutic time window.MethodsIntraluminal suture method was used to develop reversible middle cerebral artery occlusion (MACO). 36 male Kunming mice are randomly divided into sham group, ischemia-reperfusion group, ischemia-reperfusion therapy group.The therapy group according to different drug administration time is divided into: 0 h, 2 h, 4 h, 8 h 4 groups(n=6 in each group).The mice in ischemia-reperfusion therapy group were injected intraperitoneally at 0,2, 4, 8 hours after MACO(12.5 mg/kg ). The neurological function score was evaluated at 24 hours after reperfusion. Cerebral infarct volume was determined by 2，3，5-triphenyl tetrazolium staining.ResultsThe neurological function score in the groups of 0 h,2 h,4 h were lower than that in the ischemia-reperfusion group(allp<0.05), The neurological function score in 8 h group has no statistical significance. There was no significant difference among the groups which administered at different time points. The infarct volume in the groups of 0h ,2 h,4 h was(22.15±3.02)mm3，(28.61±4.19)mm3,(49.8±4.08)mm3, which was significantly smaller than that in the ischemia-reperfusion group(65.18±5.96)mm3, (allp<0.05).There Was no significant difference between the 8h group and ischemia-reperfusion group.ConclusionAcacetin can improve neurological function score and reduce the infarct volume in cerebral ischemia early stage.

AcacetinBrain ischemiaReperfusion injuryDisease modelsAnimalMice

新疆维吾尔自治区自然科学基金(2010211A56)

830001乌鲁木齐，新疆维吾尔自治区人民医院临床医学研究中心[补娟赵宗峰王慧琴张晓玲张艳君吴卫东(通信作者)]

R743

A

1007-0478(2016)04-0263-04

10.3969/j.issn.1007-0478.2016.04.012