腰果蛋白的功能特性研究及其氨基酸组成分析

刘成梅，王 芳，钟俊桢，熊 洋，顿儒艳，钟业俊（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047）

腰果蛋白的功能特性研究及其氨基酸组成分析

刘成梅，王 芳，钟俊桢*，熊 洋，顿儒艳，钟业俊
（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西南昌330047）

采用碱提法最优条件提取并酸沉得到腰果蛋白，研究了pH和温度对腰果蛋白的溶解性、起泡性及起泡稳定性、乳化性及乳化稳定性、持油性等功能特性的影响，并分析了腰果蛋白的氨基酸组成。结果表明：腰果蛋白的溶解性随pH的增加呈先降低后升高的趋势，在pH4附近溶解度最低，仅为15.90%。起泡性和乳化性随pH的变化曲线与溶解度曲线一致，在pH10时起泡性和乳化性最好，分别为13.92%、24.70 m2/g。腰果蛋白的起泡稳定性随pH的增加而逐渐增加，在pH8时达到最大为9.42%，而后趋于稳定。在碱性环境中，腰果蛋白会表现出较好的乳化稳定性，并且在80℃时其持油性最佳，为2.84 g/g。氨基酸分析表明，腰果蛋白中含有17种氨基酸，其中7种是人体必需氨基酸，含量皆高于FAO/WHO/UNO成人推荐标准，赖氨酸为第一限制性氨基酸，谷氨酸和精氨酸含量最高，分别为22.46%和9.02%。

腰果蛋白，功能特性，pH，氨基酸组成

腰果（Anacardium occidentale Linnaeus）为漆树科腰果属，多年生热带常绿乔木，热带重要干果和油料树种，其果仁是世界著名的四大果仁之一，深受世界人们喜爱［1］。腰果仁是腰果的真果部分，果仁中含有大约48%的脂肪，其中油酸和亚油酸的比例高达73.4%和11.9%，是一种高级的食用油脂［2］。除了丰富的脂肪含量外，腰果种仁中还含有21%的蛋白质和各种微量元素，如磷、钾、镁、铁等［3］。荣瑞芬等［4］通过对几种重要坚果的营养性分析发现腰果蛋白的氨基酸模式与人体氨基酸模式非常接近，是一种价值很高的优质蛋白质。

近些年来，随着人们对蛋白质需求量的大幅度增加，动物蛋白由于其昂贵的价格等诸多原因已经不能满足人们日益增长的需要。相比于动物蛋白，植物蛋白不仅资源丰富，价格低廉，而且还具有必需氨基酸含量较高，不含胆固醇等特点，可作为动物蛋白的替代物补充到人体中［5］。目前国内外已有许多关于植物蛋白开发利用的报道，其中包括蛋白提取工艺、功能特性等的研究［6-7］，而关于腰果有不少报道主要集中在对腰果仁油的提取和分析上［8-9］，对提油后产生的果粕中的蛋白质的功能性还鲜有研究。

在食品加工、储存、运输、生产过程中，蛋白质的功能性质对其起着重要作用［10］。影响蛋白质功能性质的因素一般有蛋白质的本身性质（如氨基酸组成、结构、分子大小）及蛋白质所处的环境（如温度、pH、离子强度）等［11］。在本课题组的前期研究［12］中，已对腰果蛋白的提取工艺进行了优化，得出了腰果蛋白提取的最佳工艺条件。在此基础上，本实验通过进一步深入研究不同pH和温度对腰果蛋白功能特性的影响及氨基酸组成，以期为腰果蛋白在食品加工中的开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

生腰果 购于南昌洪城大市场，储存于0～4℃；金龙鱼食用调和油 益海嘉里粮油食品有限公司；考马斯亮蓝G-250、牛血清白蛋白、十二烷基硫酸钠（SDS） 生工生物工程有限公司，分析纯；石油醚天津市大茂化学试剂厂，分析纯。

UV-1600PC紫外分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；L-8800型氨基酸分析仪 日本日立有限公司；LXJ-IIBB高速离心机 上海安亭科学仪器厂；HH-4数显恒温水浴锅 江苏省金坛荣华仪器制造有限公司；JJ-931型磁力搅拌器 江苏金坛金城国胜实验仪器厂；FE20 METTLER TOLEDO pH计 江西博力仪器设备有限公司；IKA-WERKE高速分散机 上海柏欣仪器设备厂。

1.2 实验方法

1.2.1 腰果蛋白的制备 本实验采用碱提法最佳提取工艺条件结合酸沉淀制备腰果蛋白［12］，即腰果粉碎后以1∶10的料液比与沸程60～90℃的石油醚混合并在磁力搅拌器上搅拌10 h，真空抽滤除去油脂，脱脂过程重复3次，将脱脂后的腰果粉置于通风处挥干石油醚。取100 mg脱脂腰果粉，在料液比1∶40、pH9、温度35℃下提取1.5 h，于4000 r/min离心15 min，将得到的上清液调pH至4.5，静置2 h后再次离心（4000 r/min，15 min），沉淀水洗除杂，真空冷冻干燥后，即得到纯度为87.37%的腰果蛋白。

1.2.2 腰果蛋白溶解性的测定 根据Deng等［13］的方法，分别称取50 mg腰果蛋白溶于25 mL去离子水中，用0.1 mol/L的HCl或NaOH将上述蛋白溶液分别调pH 至2、4、6、8、10，室温磁力搅拌1 h后，4800 r/min离心20 min，上清液蛋白含量采用考马斯亮蓝法以牛血清白蛋白做标准进行测定，实验重复三次。

1.2.3 腰果蛋白起泡性和起泡稳定性的测定 根据杜蕾蕾等［14］的方法，分别称取50 mg腰果蛋白溶于25 mL去离子水中，用0.1 mol/L的HCl或NaOH将上述蛋白溶液分别调pH至2、4、6、8、10，于10000 r/min下高速分散1 min，记录分散停止时泡沫体积，静置30 min后再次测定泡沫体积，计算起泡稳定性。

1.2.4 腰果蛋白乳化性和乳化稳定性的测定 根据Darine等［7］的方法，分别称取50 mg腰果蛋白溶于25 mL去离子水中，用0.1 mol/L的HCl或NaOH将上述蛋白溶液分别调pH至2、4、6、8、10，然后缓缓加入5 mL大豆色拉油，在10000 r/min高速分散机下分散1 min制成乳状液，用移液枪从底部吸取乳状液50 μL，立即与5 mL 0.1%SDS（0.1 g加水定容100 mL）混合，然后用分光光度计于500 nm处测其吸光度A0，25 min后再测一次At。其乳化性及乳化稳定性的计算公式如下：

式中：C—蛋白质浓度（g/mL）；Ø—乳化液中油的体积分数（0.25）。

式中：t—两次测定吸光度的时间间隔（min）。

1.2.5 腰果蛋白持油性的测定 根据杜蕾蕾等［14］的方法，准确称量0.5 g腰果蛋白于离心管中，测定其总质量，然后加入10 mL大豆色拉油，用高速组织捣碎机混合1 min，分别置于20、40、60、80、100℃下水浴30 min，离心沉降（4000 r/min）20 min，小心除去上层油后称重。腰果蛋白持油性的计算公式如下：

式中：W—样品的质量（g）；W1—吸油前样品和离心管总重量（g）；W2—吸油后样品和离心管总重量（g）。

1.2.6 腰果蛋白的氨基酸分析 参考文献［15］，称取100 mg腰果蛋白，用5 mL 6 mol/L的盐酸在110℃真空条件下水解24 h，将水解液定容至50 mL。取20 μL水解液，采用氨基酸分析仪测定腰果蛋白氨基酸组成。色谱柱：4.6 mm×60 mm阳离子交换树脂柱；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱液A：0.36 mol/L柠檬酸钠溶液（pH3.45）；洗脱液B：0.6 mol/L柠檬酸钠溶液（pH10.85）；洗脱液流速：0.45 mL/min；茚三酮溶液流速：0.25 mL/min；柱温：58～74℃梯度控温；检测波长（脯氨酸除外）：570 nm，脯氨酸检测波长：440 nm。

1.2.7 统计分析 所有实验重复三次，使用SPSS 19.0进行方差分析，作图采用Origin 8.5软件。

2 结果与分析

2.1 不同pH对腰果蛋白溶解性的影响

溶解性是蛋白质的“第一必需”性质，主要受pH、离子强度、温度、溶剂类型等因素的影响。如图1所示，pH-溶解度曲线基本呈现“U”字型，这与大部分蛋白质溶解曲线类似［6］。在pH2～4范围内，溶解度随pH的上升而降低，并在pH4时达到最低，仅为15.90%，其中pH2时腰果蛋白的溶解度为63.41%，当pH在4～10之间时，溶解度随pH的增加而增加，在pH10时最大，为79.39%。

蛋白质较低的溶解度常发生在等电点附近，这是由于在等电点周围，蛋白质分子表面电荷为零，分子间静电斥力减小，促使蛋白质相互聚集［16］，另一方面是由于蛋白质分子间疏水相互作用增强也使得蛋白质发生聚集而沉淀［17］。在本实验中腰果蛋白在pH4时溶解度最低，可以推测出腰果蛋白的等电点可能在pH4附近。而当pH远离等电点时，蛋白质带正或负净电，其静电排斥和离子水化作用增加，导致蛋白质分子之间不易聚集，从而增加了蛋白质的溶解度。

图1 pH对腰果蛋白溶解度的影响Fig.1 Effect of pH on the solubility of cashew nuts protein

2.2 不同pH对腰果蛋白起泡性及起泡稳定性的影响

图2 pH对腰果蛋白起泡性的影响Fig.2 Effect of pH on the foaming of cashew nuts protein

蛋白质含有亲水和疏水基团，具有典型的两亲结构，因此可以起到降低界面张力的作用［18］。从图2中可以看出腰果蛋白的起泡性随pH升高呈现先降低后升高的趋势，与溶解度的变化趋势一致。在pH4时，腰果蛋白起泡性最低，为10.2%，这可能是由于蛋白质在发挥起泡性前，首先要溶解，快速移动并吸附在气-液界面，而在pH4时蛋白质的溶解度较低，只有较少的可溶性蛋白参与到起泡过程中［19］。在pH6、8、10下腰果蛋白的起泡性分别为11.88%、13.33%、13.92%，这可能因为偏离等电点，腰果蛋白溶解度升高，溶液中有效的蛋白质含量增加，吸附到气-液界面的蛋白质分子增多，有利于界面性质发挥；另一方面在较强的酸碱条件下，蛋白质分子带有更多的静电荷，使得静电斥力增加，降低了气泡的合并，削弱了疏水相互作用，蛋白质分子柔性增加，有利于蛋白质分子快速的吸附到界面，并展开重排［20］。

蛋白质的泡沫稳定性主要由其粘度、分子间相互作用等物理特性决定［21］。如图3所示，在pH2～4之间，腰果蛋白的起泡稳定性没有显著性差异（p＞0.05），起泡稳定性相对较低。随着pH增加，起泡稳定性也逐渐增加，当pH达到8时，腰果蛋白的起泡稳定性达到最大，为9.42%。而pH继续增加时，腰果蛋白的起泡稳定性没有显著性的提升（p＞0.05）。这说明腰果蛋白在较酸或较碱环境下起泡稳定性趋于稳定，随着pH的增加，腰果蛋白的起泡稳定性整体呈现不断增加的趋势。这可能是由于随着pH的增加，腰果蛋白的溶解度增加，促进了蛋白质分子在界面形成紧密的，有粘合力的多分子层，导致粘度增加，从而增加了泡沫的稳定性［20］。

图3 pH对腰果蛋白起泡稳定性的影响Fig.3 Effect of pH on the foaming stability of cashew nuts protein

2.3 不同pH对腰果蛋白乳化性及乳化稳定性的影响

图4 pH对腰果蛋白乳化性的影响Fig.4 Effect of pH on the emulsification of cashew nuts protein

乳化特性是利用蛋白质分子结构中的亲水和亲油基团，吸附在油-水界面上，形成一层膜，从而阻止油滴的聚集，达到稳定乳化的作用。蛋白质在不同pH下，溶解性和内部电荷都是不同的，一般来说蛋白质乳化性随着表面电荷和蛋白质溶解性的增加而增强［22］。由图4可知，水溶液pH在2～4之间时，腰果蛋白质的乳化性随着pH的增高而减小，在等电点处降至最低，为13.60 m2/g。这是因为大多数食物蛋白在其等电点处溶解度较低水合作用不佳，缺乏静电排斥力，蛋白质不能迅速地移动到油-水界面，造成乳化性低［23］。随着pH由4～10继续增大时，乳化性逐渐上升，在pH10时达到最大，为24.70 m2/g。这可能是因为在碱性pH下，蛋白质所带净电荷增加，疏水力降低，且蛋白质分子柔性增加，使蛋白质分子可以迅速扩散到油-水界面，导致乳化性增加。

由图5可知，在pH2～4时腰果蛋白的乳化稳定性随着pH的增加而降低，当溶液pH处在4～6之间时，腰果蛋白的乳化稳定性没有显著性差异（p＞0.05），呈现出较差的乳化稳定性；继续增加pH，腰果蛋白乳化稳定性不断升高，并在pH8时，乳化稳定性达到最高，为16.71 min；之后升高pH对腰果蛋白的乳化稳定性没有显著性提升（p＞0.05）。由此可以发现随着pH的增加，乳化稳定性整体呈先降低后升高的趋势，pH-乳化性曲线与溶解度曲线相似。一些研究发现表明蛋白质的乳化特性和溶解性通常呈正相关［24］。

图5 pH对腰果蛋白乳化稳定性的影响Fig.5 Effect of pH on the emulsion stability of cashew nuts protein

2.4 不同温度下腰果蛋白持油性的差异

图6 温度对腰果蛋白持油性的影响Fig.6 Effect of temperature on the oil absorption

蛋白质的持油性是指蛋白质与游离油脂相结合的能力，它与蛋白质的种类、来源、加工方法、温度及所用的油脂等有关［25］。本实验主要研究了不同温度下腰果蛋白的吸油性。由图6可知，腰果蛋白在20～40℃时，持油性随温度的增加而升高，在40～60℃时，腰果蛋白持油性没有显著性差异（p＞0.05）。当温度继续升高至80℃时，持油性达到最高为2.84 g/g，当温度超过80℃时，腰果蛋白的持油性略有下降（p＜0.05）。可以看出腰果蛋白的持油性随温度的升高，整体呈现升高的趋势。这是因为蛋白质的吸油性取决于蛋白质的构象、亲水亲油基团的平衡，加热可能会引起蛋白质亚基的解聚，亲油基团暴露，造成持油性升高［26］。

2.5 腰果蛋白氨基酸组分分析

蛋白质的营养价值在一定程度上取决于氨基酸的组成。由于实验前处理过程中采用酸水解，因此色氨酸含量未进行检测［27］，其余氨基酸含量如表1所示。从表1中可知，腰果蛋白氨基酸除色氨酸外，富含17种氨基酸，7种是人体必需氨基酸，含量为29.92%，占氨基酸总量的31.62%，其中谷氨酸、精氨酸在17种氨基酸中含量最高，分别为22.46%和9.02%。与FAO/ WHO/UNO推荐值相比，腰果蛋白所含氨基酸都能满足成人的需要，而赖氨酸、含硫氨基酸（甲硫氨酸和半胱氨酸）、含苯环氨基酸（苯丙氨酸和酪氨酸）、组氨酸不能满足儿童的需求。在腰果蛋白中酸性、碱性、疏水性氨基酸分别占氨基酸总量的29.04%、14.60%、39.37%，表明腰果蛋白是一种酸性蛋白质。根据氨基酸评分值发现赖氨酸为腰果蛋白的第一限制性氨基酸，这与Venkatachalam等［28］的报道一致，而在Aremu等［29］的研究中发现缬氨酸是腰果蛋白的第一限制性氨基酸，这可能是由于腰果生长环境的不同、品种的差异对结果造成的差异。

表1 腰果蛋白氨基酸含量Table1 Amino acid content of cashew nut protein

3 结论

腰果蛋白的溶解性随pH变化曲线呈“U”字型，在pH4附近溶解性最低，仅有15.90%，腰果蛋白的起泡性和乳化性随pH的变化曲线与溶解度曲线一致，在pH10下，起泡性和乳化性最好，分别为13.92%、24.70 m2/g。起泡稳定性随pH的增加不断增加，最后趋于稳定，乳化稳定性随pH的变化总体呈现先降低后升高的趋势。在80℃时，腰果蛋白的持油性最好，为2.84 g/g。氨基酸分析表明：除色氨酸外，腰果蛋白中富含17种氨基酸，其中包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸等7种人体必需氨基酸，且含量均高于FAO/WHO/ UNO成人推荐标准。非必需氨基酸中谷氨酸和精氨酸的含量较高，分别为22.46%和9.02%。腰果蛋白作为一种优质的植物蛋白资源，具有极大的开发潜力。

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Functional properties and amino acid composition of cashew nut protein

LIU Cheng-mei，WANG Fang，ZHONG Jun-zhen*，XIONG Yang，DUN Ru-yan，ZHONG Ye-jun
（State Key Laboratory of Food Science and Technology，Nanchang University，Nanchang 330047，China）

The cashew nut protein was prepared under the optimized conditions via alkali extraction and acid precipitation method，while the effects of pH and temperature on the solubility，foaming and foaming stability，emulsification and emulsion stability，oil absorption were investigated and the amino acids composition of cashew nut protein also had been analyzed.The results showed that the solubility of cashew nut protein decreased first and then increased with the increase of pH，while the minimum solubility was found to be 15.90%at pH4.Foaming and emulsification profiles of cashew nut protein were consistent with the solubility profiles.The maximum foaming and emulsification of 13.92%，24.70 m2/g were obtained at pH10 respectively.Foaming stability of cashew nut protein were gradually increased with the increase of pH and reached the maximum（9.42%）at pH8.In alkaline environment，cashew nut protein showed a better emulsion stability.Cashew nut protein obtained the best oil absorption（2.84 g/g）at 80℃.Amino acid analysis showed the cashew nut protein contains 17 kinds of amino acids which 7 kinds were the essential amino acids.The content of amino acids all were higher than the standard recommended by FAO/WHO/UNO for adults while lysine was the first limited amino acid and glutamic acid，arginine were the most abundant，respectively 22.46%and 9.02%.

cashew nut protein；functional properties；pH；amino acids composition

TS255.1

A

1002-0306（2016）02-0088-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.009

2015－05－04

刘成梅（1963-），男，博士，教授，研究方向：食物资源利用与开发，E-mail：916504978@qq.com。

*通讯作者：钟俊桢（1984-），女，博士，副研究员，研究方向：食品科学与工程，E-mail：zhongjunzhen@163.com。

公益性行业（农业）科研专项（201303077）。