食品加工环境因素对双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用的影响

刘国荣，宋振芹，郜亚昆，刘 力，黄宝珠，李雯晖（.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，食品质量与安全北京实验室，北京00048；.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京00083）

食品加工环境因素对双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用的影响

刘国荣1，宋振芹1，郜亚昆1，刘 力2，黄宝珠1，李雯晖1
（1.北京工商大学食品添加剂与配料北京高校工程研究中心，食品质量与安全北京实验室，北京100048；2.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083）

为预测双歧杆菌细菌素BB04在食品工业中的实际应用效果，本研究分别从抑菌效果和吸附特性两个角度探讨了食品加工过程中常涉及到的温度、pH和盐等因素对细菌素作用于敏感菌单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的影响。结果表明：细菌素对单核细胞增生李斯特菌作用方式为杀菌；37℃、pH6.0时，抑菌效果最佳；实验所选取的NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2四种盐对细菌素的抑菌作用都有一定协同效应，各盐之间及同种盐内不同浓度间差异显著（p＜0.05）。吸附特性实验结果发现，pH对该细菌素吸附单核细胞增生李斯特菌细胞有一定影响，在pH6.0吸附效果最佳，吸附率可达91.40%；所选取的四种盐对细菌素的吸附作用都有一定拮抗效应，各盐之间及同种盐内不同浓度间差异显著（p＜0.05）；温度对其吸附作用影响不显著（p＞0.05）。研究结果为该细菌素在食品防腐保鲜中合理应用提供一定的科学依据和理论参考。

双歧杆菌细菌素，单核细胞增生李斯特氏菌，温度，pH，盐

乳酸菌活性代谢产物细菌素是乳酸菌在其生长代谢过程中通过自身核糖体机制合成并分泌到环境中的一类具有抑菌活性的蛋白类物质，在人体内可降解，具有高效、安全、无毒等特点，在天然食品生物防腐剂研究与开发中有着巨大应用潜力，已成为生物防腐剂开发的热点。目前只有乳酸链球菌素（nisin）被批准应用于食品工业，对于其他类具有抑菌活性作用细菌素的研究多限于筛选优化及一般特性的描述，对其抑菌特性影响研究鲜有报道。所以开发新的乳酸菌细菌素作为天然食品防腐剂、饲料添加剂、发酵剂和医药用剂，成为许多研究工作的热点［1-2］。

双歧杆菌是公认的安全菌，广泛参与人体的消化、营养、代谢、吸收等过程，已有研究报道少量的双歧杆菌菌株也可产生细菌素［2-3］，能抑制食品有害菌的生长，有望作为新型生物防腐剂用于食品的防腐保鲜。本课题组前期从母乳婴儿粪便中自主分离出一株产细菌素动物双歧杆菌BB04，并对其所产细菌素进行了提纯及相关特性研究［4］，发现该细菌素是一种具有良好的热稳定性和酸碱耐受性的蛋白类物质，具有较高的安全性。其抑菌效果明显且抑菌谱较广，不仅对李斯特菌、金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌有很强的抑制作用，而且对大肠杆菌等阴性菌也表现出很好的抑菌活性，显示了其作为食品防腐剂的良好应用前景。

业已发现，乳酸菌细菌素的抑菌活性受多种环境因素的影响，如食品加工工艺、包装、贮藏方式等［5-6］，因此研究食品加工环境中常见理化因素对细菌素抑菌效果的影响，对其在食品产业中正确合理应用具有重要的指导意义。

本文为预测双歧杆菌细菌素BB04在食品工业中的实际应用效果，以纯化后的双歧杆菌细菌素BB04为试材，分别从抑菌效果和吸附特性两个角度探讨了食品加工环境中常涉及到的温度、pH和盐等因素对细菌素作用敏感菌单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）的影响，并初步探讨了细菌素抑菌作用和吸附作用之间的相关性，以期为该细菌素在食品防腐保鲜中合理应用提供一定的科学依据和理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

纯化后动物双歧杆菌细菌素BB04（效价640 AU/ mL，以观察到抑菌圈出现的最高稀释度定义为1个活力单位（1 AU），其倒数即为细菌素的效价） 由北京工商大学发酵工程实验室提供；指示菌：单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）35152（4b）

卫生部药品生物制品检定（NICPBP）；培养基 改良MRS固、液培养基（普通MRS培养基中加入0.3%玉米浆和0.03%L-半胱氨酸盐酸）TSBYE、TSBYA培养基等；NaCl、（NH4）2SO4、KCl、MgSO4、CaCl2、NaOH、HCl、Na2HPO4、NaH2PO4、无水乙醇等 北京蓝弋化工产品有限公司。

pH S-25型酸度计 上海精密科学仪器有限公司；Supra 22K高速冷冻离心机 韩国翰尼（Hanil）公司；LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器 上海申安医疗器械厂；HJ-6多头磁力搅拌器 北京冠测精电仪器设备有限公司；智能型电热恒温鼓风干燥箱 上海琅玕实验设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 指示菌菌悬液制备 将对数生长期的单核细胞增生李斯特菌（L.monocytogenes）35152（4b）发酵液，8000 r/min离心10 min，5 mmol/L（pH7.0）HEPES缓冲液洗涤沉淀3次，并重悬于该缓冲液中，制备菌悬液（106CFU/mL）［7］，备用。

1.2.2 双歧杆菌细菌素BB04作用方式及抑菌效果的确定 采用稀释涂布平板计数法，将5 mL指示菌菌菌悬液（初始菌数控制在106CFU/mL）与1 mL纯化细菌素样品（640 AU/mL）于离心管中混合均匀［8-9］，37℃，育孵24 h，每隔3 h取样1 mL，各取三个稀释度，接种于无菌TSBYE培养基，育孵18 h后，采用平板计数法，记录活菌数，以不添加细菌素样品的细胞悬浮液作为对照，实验重复三次。

1.2.3 双歧杆菌细菌素BB04效价分析及吸附率测定

采用牛津杯双层琼脂平板扩散法测定细菌素样品的抑菌活性，以乳酸链球菌素（nisin）为阳性对照，并以标准曲线法测定细菌素的相对抑菌效价，得细菌素效价回归方程为y=0.2009x+2.8876，R2为0.9939，其中x为实验所得抑菌圈直径：20.00 mm；y为nisin效价的对数值。

吸附率测定参考Rongguang［10］吸附率测定方法，具体吸附率测定表达公式如下：

吸附率（%）=［1-（样品上清AU-对照ⅠAU）/对照ⅡAU］×100

1.2.4 加工环境对双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用的影响

1.2.4.1 pH的影响 将1 mL纯化制备后的细菌素样品液（640 AU/mL）与指示菌菌悬液于离心管中混合摇匀，采用5%的磷酸和1 mol/L NaOH调pH分别为4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0［11-12］，37℃，育孵24 h，以不添加细菌素样品为对照，采用稀释涂布平板计数法，同1.2.2，记录活菌数，平行实验三次。

1.2.4.2 温度的影响 实验选取7、15、25、37、44℃五个食品加工环境常见温度，细菌素样品液（640 AU/mL）与指示菌菌悬液添加量同上，在其各自温度条件下分别育孵24 h，采用平板计数法，测定方法同1.2.2，平行实验三次，记录活菌数。

1.2.4.3 盐离子影响 选取NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2四个食品加工环境中常见无机盐（盐浓度分别为10、50、100、200 mmol/L）［13-14］。接种量及细菌素添加量同

1.2.4.1 ，采用不添加盐离子的5 mmol/L的磷酸缓冲液和细菌素混合液为对照，37℃，育孵24 h，采用稀释涂布平板计数法，实验方法同1.2.2，平行实验三次，记录活菌数。

1.2.5 加工环境对双歧杆菌细菌素BB04吸附特性的影响

1.2.5.1 温度的影响 分别移取5 mL指示菌菌悬液分装于离心管内，注入1 mL细菌素样品液（640 AU/mL）混匀，重悬于5 mmol/L的磷酸钠缓冲液中（pH7.0），定容至10 mL，以不添加细菌素样品液为对照，混合体系分别置于不同温度条件下（7、15、25、37、44℃），育孵2 h，10000 r/min离心10 min，取上清液，测定吸附率。

1.2.5.2 pH的影响 采用5 mol/L磷酸和1 mol/L NaOH配制pH4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的磷酸缓冲液，将指示菌菌悬液与细菌素样品液以5∶1添加量混匀，混合体系重悬于5 mmol/L不同pH磷酸缓冲液中，37℃育孵2 h，离心，取上清液，分别测定处理前后细菌素吸附率。

1.2.5.3 盐离子的影响 分别选取NaCl、KCl、MgCl2、CaCl2为测试无机盐（配制盐浓度分别为10、50、100、200 mmol/L），指示菌菌悬液与细菌素样品液添加量同1.2.5.1，混合体系分别重悬于无菌盐溶液中，以不含盐离子的磷酸缓冲液为对照，37℃，育孵2 h，10000 r/min离心10 min，取上清液，测定细菌素处理前后指示菌的细胞吸附率。

2 结果与分析

2.1 双歧杆菌细菌素BB04作用方式的确定

如图1所示，经双歧杆菌细菌素BB04处理3 h后，单核细胞增生李斯特氏菌活菌数迅速降至103CFU/mL左右，处理至9 h时，活菌数降至102CFU/mL以下，处理至12 h后活菌数基本稳定，而未加细菌素的对照随着培养时间的延长3 h后呈上升趋势，9 h接近稳定，与实验组活菌数形成显著差异（p＜0.05）。以上结果充分说明双歧杆菌细菌素BB04的添加可以在很短时间内快速杀死部分指示菌，并初步判断该细菌素的作用方式为杀菌。相关类似研究也指出细菌素的作用方式同样与细菌素本身剂量、指示菌浓度以及指示菌的生理活性状态等有一定相关性，实验结果为细菌素在食品加工中剂量添加应用提供了一定的理论参考。

图1 双歧杆菌细菌素BB04作用方式的确定Fig.1 The mode of action of bifidocin BB04 produced by Bifidobacterium

2.2 加工环境对双歧杆菌细菌素BB04抑菌效果的影响

2.2.1 pH的影响 如图2可示，双歧杆菌细菌素BB04 在pH4.5～8.0条件范围内对单核细胞增生李斯特氏菌均有抑菌作用，其活菌数在pH4.5～6.0范围内，随着pH的升高而降低，在pH为6.0时活菌数最低，有最佳抑菌效果，且菌落数控制在103CFU/mL左右，当pH高于6.0后，抑菌活性降低，活菌数呈缓慢上升趋势。实验结果表明pH对细菌素作用指示菌的抑菌活性有影响显著（p＜0.05），其原因可能为过高或过低pH会造成细菌素结构发生改变，使其活性降低［17］，另外过低pH有可能影响细菌素对指示菌的吸附作用，从而不能充分发挥细菌素对指示菌抑菌作用。

2.2.2 温度的影响 实验选用食品加工储藏环境中常用的五种温度，结果如图3所示，高温37℃条件下，细菌素抑菌效果最佳，经细菌素样品液处理过的指示菌活菌数控制103CFU/mL左右，与对照敏感菌生长趋势形成显著差异（p＜0.05）；在低温7、15℃环境下，抑菌活性降低，活菌数控制在106CFU/mL左右。以上实验结果表明，高温下使用该细菌素可以在短时间内迅速降低初始活菌数，并可控制活菌数在稳定水平，细菌素活性较强，抑菌效果较佳，能更好的发挥防腐保鲜作用。

图2 pH对双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用的影响Fig.2 Effect on antimicrobial activity of bifidocin BB04 at various pH

图3 温度对双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用的影响Fig.3 Effect on antimicrobial activity of bifidocin BB04 at various tempeture

图4 盐离子对双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用的影响Fig.4 Effect on antimicrobial activity of bifidocin BB04 at various salts

2.2.3 盐离子的影响 盐离子对双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用的影响结果如图4所示，实验选用食品加工储藏环境中常见四种盐类，在实验浓度范围内，不同种盐的存在同时降低了该细菌素对单核增生李斯特菌的抑菌作用，且表现出Mg2+、Ca2+二价金属离子对该细菌素抑菌作用影响大于Na+、K+一价金属离子，而同种盐不同浓度间的差异对细菌素抑菌作用效果差异显著（p＜0.05）；在无盐的磷酸缓冲液对照中，该细菌素对指示菌呈现出一定拮抗作用，其原因可能为带正电荷的金属离子能结合到菌体带负电荷的磷脂上，从而减弱了细菌素对指示菌的吸附效果，降低了细菌素抑菌活性。

2.3 加工环境对双歧杆菌细菌素BB04吸附特性的影响

2.3.1 温度的影响 实验结果如图5所示，结果表明，温度对细菌素吸附单增李斯特氏菌吸附效果影响显著（p＜0.05），温度处于15～37℃温度范围间，细菌素对指示菌细胞均有较好吸附作用，吸附率均达65%以上，在37℃温度条件下，有最佳吸附，吸附率为91.14%；在7℃时，吸附率有所降低，比室温降低了18.56%（图5）。以上结果充分表明该细菌素吸附敏感菌有较宽的温度耐受性，显示了其在食品加工防腐过程中具有更广阔的应用前景。

图5 温度对双歧杆菌细菌素BB04吸附率的影响Fig.5 Influence of temperature on the absorption of bifidocin BB04

2.3.2 pH的影响 实验结果如图6所示，双歧杆菌细菌素BB04吸附特性受pH影响显著（p＜0.05）。在pH4.5～8.0之间，该细菌素对敏感菌细胞均有吸附作用。其吸附率在pH4.5～6.0范围内，随着pH增大而增大，pH6.0时，吸附效果最佳，吸附率可达91.40%；在pH为6.5时有所下降，当pH高于7.0后吸附率明显降低，其原因可能为偏酸偏碱性环境会对细菌素二级结构发生一定程度上的改变，使其细菌素无法吸附于菌体。

图6 pH对双歧杆菌细菌素BB04吸附率的影响Fig.6 Influence of pH on the absorption of bifidocin BB04

2.3.3 盐离子的影响 实验选取食品加工环境常见四种盐类，结果如表1所示，由表1可知，各种盐离子的存在对细菌素吸附指示菌有一定程度影响作用，较低离子浓度（10 mmol/L）环境中，不同盐类之间，Na+对细菌素吸附影响作用高于同一浓度下的Mg2+、Ca2+和K+，吸附率可达84.32%；同种盐类的不同离子浓度对细菌素吸附率影响显著（p＜0.05），随着盐离子浓度的升高，盐离子的促吸附作用明显降低，拮抗作用明显增强，当盐离子浓度增大到200 mmol/L时，细菌素无法吸附到指示菌细胞上。其原因主要可能为阳离子的大量存在会导致细菌素氨基酸表面的电荷发生变化［17］，从而使细菌素二级结构发生变化，形成转角的概率降低，吸附率降低。

表1 盐离子对细菌素吸附率的影响Table1 Influence of salt ions on the absorption of bifidocin BB04

2.3.4 细菌素抑菌特性和吸附作用之间相关性探讨

双歧杆菌细菌素BB04在实验选取pH条件范围（4.50～8.0）内作用单核细胞增生李斯特氏菌，在起始活菌数差异不显著的情况下，经37℃作用24 h后，其活菌数随着pH的升高而降低，pH6.0时达到最低，随后有所上升。表明pH对细菌素抑菌作用影响显著（p＜0.05），pH6.0的条件下其抑菌效果最好。结合图5 中pH对双歧杆菌细菌素BB04吸附作用的影响可以看出，在pH4.5～6.0范围内，吸附率随着pH增大而增大，pH6.0时，吸附效果最佳，吸附率可达91.40%，造成这种现象的原因可能是：一方面，低pH影响该细菌素的吸附作用；另一方面，较高的pH下细菌素活性有所损失。实验结果在一定程度上证实了细菌素只有充分吸附在指示菌细胞表明，才能发挥较好抑菌作用。

观察表1所示，盐离子对细菌素的吸附特性影响显著（p＜0.05），实验所选取的四种盐对细菌素的吸附作用均有一定的拮抗效应，各盐之间及同种盐内不同浓度间差异显著（p＜0.05），随着盐离子浓度的升高，吸附作用效果降低，拮抗作用显著增强，当盐离子浓度增大到200 mmol/L时，细菌素无法吸附到指示菌细胞上。结合图2及图4有关指示菌活菌数的测定结果，发现pH和盐对双歧杆菌细菌素BB04吸附作用的影响与pH和盐对细菌素作用单核细胞增生李斯特氏菌的影响之间没有相关性，与Atrih［15］报道相一致。

3 讨论

实验中，双歧杆菌细菌素BB04抑菌作用受温度和酸碱度影响显著（p＜0.05），显示出一定的选择性，温度较高时可迅速降低活菌数且将其控制在一定水平；在pH6.0下抑菌作用效果最好，pH过高或过低都会造成活性降低，pH酸碱度对细菌素的抑菌作用有可能为对其结构的改变导致活性的降低或完全丧失，或是影响了细菌素对指示菌的吸附作用，从而不能充分发挥抑菌作用。国内外相关研究表明，温度和pH对细菌素的抑菌作用的影响不尽相同。Sophie［17］对一种抑制无害李斯特氏菌粪肠球菌素EFS2的研究发现该细菌素在低于15℃时几乎没有抑菌作用，同样较低的pH下（pH4.5）该细菌素也没有抑菌活性，Sophie对此的解释为低温影响了粪肠球菌素EFS2的溶解性和改变了构象，较低的pH则可能通过改变细菌素的结构而引起活性的丧失［17］。由此，在食品生产尤其是肉类或即食食品的生产实践中，应当注意双歧杆菌细菌素BB04的适用条件，在低温制品、pH中性的食品中使用时，不易受到破坏，活性较强，能更好的发挥保鲜效果。常温或较高的温度下前期使用该细菌素作为防腐剂，后期结合其他防腐保鲜技术则效果更好。

在加工环境对双歧杆菌细菌素BB04吸附特性的影响实验中，pH对细菌素BB04的吸附作用影响显著（p＜0.05），较低的pH下没有吸附作用发生，但在pH6.0～7.5下吸附率都达到80%以上，对细菌素吸附特性的研究中，Hurst［18］和Bhunia［19］分别报道了pH对nisin和片球菌素AcH吸附作用有显著影响。Rongguang［10］的研究发现pH对片球菌素AcH、nisin、sakacin A和明串珠菌素Lcm1吸附产生菌和指示菌的能力有显著影响，同样Atrih［20］也得到相同的结论。有关盐对细菌素吸附作用影响的报道不是很多，仅有的研究显示盐离子的存在降低了细菌素吸附指示菌的能力，本实验中，盐对细菌素的吸附作用拮抗作用显著（p＜0.05），盐对细菌素其吸附特性的影响有待进一步探讨研究。

4 结论

4.1 经透析纯化后的细菌素对单核细胞增生李斯特菌作用方式为杀菌。

4.2 高温37℃下，细菌素抑菌效果最佳，添加细菌素可以短时间内迅速降低初始活菌数至103CFU/mL左右。

4.3 实验选用的八种pH条件，在pH6.0时，抑菌效果最佳。

4.4 实验所采用的四种盐对细菌素的抑菌作用都有一定拮抗效应，各盐之间及同种盐内不同浓度间差异显著（p＜0.05）。

4.5 pH对吸附作用效果影响显著（p＜0.05），pH6.0时有最佳吸附，吸附率为91.40%；而温度和盐对其吸附作用影响不显著（p＞0.05）。

研究结果对双歧杆菌细菌素BB04食品加工特性进行了全面详细探讨，为该细菌素在食品加工、防腐保鲜过程中合理的添加应用提供了一定的科学依据与理论参考，对其在防腐抑菌领域的实际应用具有一定指导意义。

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Effect of environmental factors in food processing on the inhibitory actvity of bifidocin BB04

LIU Guo-rong1，SONG Zhen-qin1，GAO Ya-kun1，LIU Li2，HUANG Bao-zhu1，LI Wen-hui1
（1.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing Laboratory for Food Quality and Safety，Beijing Technology and Business University，Beijing 100048，China；2.College of Food Science&Nutritional Engineering，China Agricultural University，Beijing 100083，China）

In order to predict the practical application of bifidocin BB04 in the food industry，the influence of temperature，pH and salts in food processing on the inhibitory actvity and adsorption properties of bifidocin BB04 agianst Listeria monocytogenes was studied.Results showed that the mode of action of bacteriocins against L.monocytogenes was bactericidal.The remarkable reduction inactivity was observed at 7℃ and pH6.0.The difference between various salts was significant（p＜0.05），as well as the difference between three different concentrations of the same salt.Adsorption tests showed that pH had a certain effect on the adsorption of bacteriocins act on L.monocytogenes cells.The highest adsorption rate（91.40%）was occurred at pH 6.0.The difference between various salts was significant（p＜0.05），as well as the difference between three different concentrations of the same salt while the influence of temperature on the adsorption effect was not significant （p＞0.05）.Results provide certain scientific basis and theoretical reference for bacteriocins reasonable application in food preservation.

bifidocin；Listeria monocytogenes；temperature；pH；salts

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0125-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.016

2015－05－22

刘国荣（1983－），女，博士，副教授，研究方向：食品微生物学，E-mail：liuguorong@th.btbu.edu.cn。

国家自然科学基金青年基金项目（31201407）；北京市科技计划项目（Z151100001215008）；北京市自然科学基金预探索项目（5133034）。