3种二苯乙烯类化合物的稳定性研究

喻 艳，向 伟，刘俊池，徐 立（西南大学生物技术学院，重庆400715）

3种二苯乙烯类化合物的稳定性研究

喻 艳，向 伟，刘俊池，徐 立*
（西南大学生物技术学院，重庆400715）

采用超高效液相色谱仪（UPLC）测定白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷A含量的变化，分别研究了温度、光照和酸碱度对3种化合物稳定性的影响。结果表明3种化合物在不同温度下，其有效期不同，白藜芦醇在4℃下可保存74.67年，氧化白藜芦醇在-40℃下有效期可达11.44年，而桑皮苷A在-40℃下的有效期可达3.65年。光照对3种化合物稳定性的影响效应依次为：桑皮苷A＞氧化白藜芦醇＞白藜芦醇；白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷A的最适pH分别为3.24、5.38和4.3。这些结果为3种化合物的提取、分离、储存、运输与开发利用提供了有效参考。

白藜芦醇，氧化白藜芦醇，桑皮苷A，稳定性，超高效液相色谱

在传统医学上，桑树的各个部位都可以入药，近年来国内外相关学者对桑属植物各个部位的化学成分、生物活性、药理作用、临床应用等方面都做了较为系统的研究［1-4］，发现了一系列重要的生物活性成分，白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷A就是从桑树皮中发现的一类具有多种生物活性的二苯乙烯类化合物，并受到了各领域越来越多研究人员的关注。白藜芦醇活性显著，对心血管具有双向调节作用，能改善微循环，具有显著的抗炎、抗氧化、降血糖、保护肝脏以及抗癌等多方面的活性［5］；氧化白藜芦醇是一种高效的酪氨酸酶抑制剂［6］，具有皮肤色素沉淀、抗炎［7］、抗氧化［8-9］、降血糖及果蔬防腐抗菌［10］等活性；桑皮苷A是植物的抗菌素，是植物受到病菌感染、紫外线照射或者化学污染等刺激时产生的物质，能治疗酒精肝、抗炎、镇痛、止咳等［11］。有效地保持这3种天然活性物质在提取、分离纯化、储存等研究及生产过程中的稳定性是非常必要的，但只有对白藜芦醇在有机溶剂溶解性、紫外光和可见光照射的稳定性方面有研究［12-13］，其余两种物质的稳定性研究鲜见报道。

化合物所处的溶剂环境、温度、光线、pH以及环境中的一些物质如添加物［14］、金属离子［15］、氧化剂［16］、还原剂［17］都会影响化合物的稳定性［18］。但在研究、生产、储存的过程中，影响天然活性物质稳定性的因素最主要包括温度、酸碱度及光照。基于此，本实验研究了温度、光照及酸碱度对白藜芦醇、氧化白藜芦醇、桑皮苷A稳定性的影响，以期为3种物质的提取、分离、贮存、生产等研究以及桑树的开发提供实用信息。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

白藜芦醇标准品 纯度≥98%，上海生工生物工程技术服务有限公司；氧化白藜芦醇标准品（纯度≥98%）、桑皮苷A标准品（纯度≥98%） 成都曼思特生物有限公司；磷酸二氢钠 分析纯，成都市科龙化工试剂厂；柠檬酸 分析纯，重庆川东化工有限公司；甲醇 色谱级，美国Sigma公司。

ACQUITY UPLC I-Class超高效液相色谱 美国waters公司；FA2104电子天平 上海精天电子仪器有限公司；数控超声波清洗器 频率40 kHz，最大输出功率700 W，昆山市超声仪器有限公司；Direct-QTM纯水仪 法国Millipore公司；HH-2恒温水浴锅 国华电气有限公司；RXZ-300C智能人工气候箱 宁波东南仪器有限公司；TES 1332A数字照度计 台湾泰仕TES公司；pHS-3C+酸度计 方舟科技。

1.2 实验方法

1.2.1 温度对3种二苯乙烯类化合物的处理 精确配制10 μg/mL的白藜芦醇标准品溶液，分装到若干个25 mL的棕色容量瓶中并定容。将其置于温度分别为60℃（分别设置0、2、4、6、8、10 h 6个处理时间）、70℃（分别设置0、1.5、3、4.5、6、7.5 h 6个处理时间）、80℃（分别设置0、1、2、3、4、5 h 6个处理时间）、90℃（分别设置0、0.5、1、1.5、2、2.5 h 6个处理时间）的恒温水浴锅中热处理，热处理结束后快速取出置于冷水中，迅速降至室温，定容，过0.22 μm微孔滤膜，用UPLC测定其含量，每个处理设置3个重复。氧化白藜芦醇和桑皮苷A的处理同白藜芦醇。

1.2.2 光照对3种二苯乙烯类化合物的处理 精确配制10 μg/mL的白藜芦醇标准品溶液，以8 mL为单位分别装到若干个棕色样品瓶和若干个白色样品瓶中。然后将样品瓶放入光照强度为（5500±200）lux的恒温培养箱中日光灯进行光照，分别处理0、2、4、6、8、10、12、14、16、24 h后，过0.22 μm微孔滤膜，用超高效液相色谱测定其含量，每个处理设置3个重复。氧化白藜芦醇、桑皮苷A的操作方法同上。

1.2.3 pH对3种二苯乙烯类化合物的处理 配制不同pH2、3、4、5、6、7、8的磷酸二氢钠-柠檬酸缓冲液，用酸度计实际测得缓冲液的pH分别为2.4、3.24、4.3、5.38、6.26、7.12、8.11。用柠檬酸缓冲液精确配制50 μg/mL白藜芦醇溶液，分别取2 mL置于10 mL棕色容量瓶中，于室温、黑暗环境放置4 h后，过0.22 μm微孔滤膜，然后用UPLC测定其含量，每个处理设置3个重复。氧化白藜芦醇和桑皮苷A的操作方法同上。

1.2.4 3种二苯乙烯类化合物含量的UPLC测定 精确配制50 μg/mL的白藜芦醇标准品溶液150 mL，作为母液待用。从母液中取25 mL以对半稀释法配制成浓度为50、25、12.5、6.25、3.125 μg/mL的白藜芦醇梯度溶液。过0.22 μm微孔滤膜，用UPLC测定，每组设置3个重复，以浓度为横坐标X，以三种化合物的含量为纵坐标Y绘制标准曲线。氧化白藜芦醇和桑皮苷A的操作方法同上。

预实验得到UPLC的检测条件。白藜芦醇的UPLC检测条件为：1.7 μm C18（2.10 mm×50 mm）ACQUITY UPLC®BEH色谱柱，流动相：甲醇∶水=50∶50（v/v），流速0.35 mL/min，检测波长306 nm，进样量0.7 μL，柱温30℃。氧化白藜芦醇和桑皮苷的UPLC检测条件为：1.7 μm C18（2.10 mm×50 mm）ACQUITY UPLC®BEH色谱柱，流动相：甲醇∶水=45∶55（v/v），流速0.35 mL/min，检测波长306 nm，进样量0.7 μL，柱温30℃。

1.2.5 数据分析 数据用Origin 7.5作图，SPSS 17.0分析。

2 结果与分析

2.1 3种化合物的UPLC分析及其标准曲线

图1 3个化合物的UPLC色谱图Fig.1 The UPLC chromatogram of three compounds compounds

白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷A的标准曲线的线性回归方程分别为Y=9.23e+003X+3.03e+003 （R2=0.990978）、Y=6.60e+003X+3.65e+003（R2= 0.99249）和Y=3.95e+003X-3.81e+001（R2=0.999954），其线性范围均为3.125～50 μg/mL。如图1所示，三者的保留时间分别为0.57、0.54、0.37 min，色谱吸收峰都较明显，说明它们的检测条件可行。

2.2 温度对3种化合物稳定性的影响

根据Arrhenius定律［18］：

其中K是反应速度常数；A是频率因子；E为活化能；R为气体常数；T是绝对温度。以lgK对1/T作图得一直线，直线斜率=-E/（2.303R），由此可计算出活化能E。将直线外推至室温，就可以得出室温时的速度常数K25℃，由K25℃可求出分解10%所需的时间t0.9。在药物降解反应中常将药物在室温下降解10%所需的时间（t0.9）作为有效期。

表1 温度对3种化合物的影响Table1 Effect of temperature on three compounds

据Arrhenius定律以lgK对1/T作线性回归（见表1），得直线方程白藜芦醇：lgK=-4869.2/T+12.453；氧化白藜芦醇：lgK=-3310/T+8.2278；桑皮苷A：lgK=-2618.2/ T+5.755；将室温25℃（T=298 K）代入直线方程，得室温反应速度常数K25℃白藜芦醇=1.2984×10-4/h，代入公式t0.9=0.1054/K25℃=33.8 d；K25℃氧化白藜芦醇=1.3195×10-3/h，代入公式t0.9=0.1054/K25℃=3.33 d；K25℃桑皮苷A=9.311×10-4/h，代入公式t0.9=0.1054/K25℃=4.7 d。即在25℃下白藜芦醇的有效期为33.8 d，氧化白藜芦醇有效期为3.33 d，桑皮苷A有效期为4.7 d。

同样的，理论上放置于4℃冰箱保存，白藜芦醇、氧化白藜芦醇、桑皮苷A有效期分别为1.61年、23.13 d、21.8 d。置于-20℃环境中存放，白藜芦醇、氧化白藜芦醇、桑皮苷A有效期分别为74.67年、314.6 d、172.8 d。存放于-40℃冰箱中，氧化白藜芦醇、桑皮苷A有效期分别为11.44年、3.65年，白藜芦醇有效期则更长，达数百年。

结果表明，白藜芦醇在4℃条件下保存稳定性较好，-20℃条件下稳定性非常好。氧化白藜芦醇在室温下非常不稳定，贮存在-40℃条件下，有效期可达到11.44年，稳定性非常好。桑皮苷A在室温、4℃条件下均非常不稳定，在-40℃条件下贮存有效期可达3.65年，低温贮存大大提高了桑皮苷A的稳定性。

2.3 光照对3种化合物稳定性的影响

3 种化合物经过（5500±200）lux的强光照射后，其各个处理的含量如图2所示。

图2 光照对3种化合物稳定性的影响Fig.2 Effect of light on stability of three compounds

由图2可知，随着光照时间延长，白色瓶和棕色瓶中3种化合物的含量均出现了降低的趋势，且同种化合物的棕色瓶中含量的变化明显比白色瓶中含量的变化平缓，说明棕色瓶对3种二苯乙烯类化合物有保护作用，可提高其稳定性。光照初期，白色瓶中的白藜芦醇、氧化白藜芦醇、桑皮苷A分别处理12 min后，其含量分别下降了28.28%、59.13%、77.73%，说明桑皮苷A和氧化白藜芦醇光敏感性很高，白藜芦醇相对较低。随着光照时间的延长，化合物浓度降低到一定程度后，便趋于平稳。3种化合物在棕色瓶和白色瓶中处理24 h后的含量差分别为：3.815、0.863、4.215 μg/mL。光照对3种二苯乙烯类化合物的稳定性影响从大到小的排列顺序为：桑皮苷A＞氧化白藜芦醇＞白藜芦醇。因此，3种化合物见光均易降解，不稳定，应于黑暗处保存和处理。

2.4 pH对3种化合物稳定性的影响

图3 pH对3种化合物稳定性的影响Fig.3 Effect of pH value on stability of three compounds

用酸度计测定所配制的缓冲溶液的pH，测定结果为：2.4、3.24、4.3、5.38、6.26、7.12、8.11。发现实际测定结果值比理论值偏高，这可能是柠檬酸因放置后受潮，所配溶液中的柠檬酸浓度偏低所致。

如图3所示，白藜芦醇在pH3.24左右最稳定。pH在2.4～6.26间，白藜芦醇的含量变化不大，说明白藜芦醇在此pH范围较为稳定；而pH在7.12时，白藜芦醇的含量降为0 μg/mL，说明白藜芦醇在中性和碱性环境中极不稳定。氧化白藜芦醇的最适pH约为5.38。在pH2.4～6.26范围内，相对其它两种化合物氧化白藜芦醇的含量变化较为明显，再所配制的标准浓度的基础上减少了45%左右。桑皮苷A的最适pH约为4.3。pH为2.4时，桑皮苷A的含量相对于标准品浓度减少了30%左右，而pH在3.24～7.12范围内，桑皮苷A含量相对于pH2.4时略有增加，可能是由于实验过程中溶剂挥发，导致溶质物质的量增加而出现的桑皮苷A含量增加。在pH为8.11时，未检测到桑皮苷A的含量。3种化合物在中性和碱性条件下都不稳定，主要原因是其含有多个酚羟基，有较强的失电子能力，性质比较活泼，易被氧化成醌类物质［19］。当然酸或碱可使溶液中不同的反应速度增大，即发生了催化作用，无论酸或碱催化反应中，都是以质子转移来完成反应，这是酸碱催化的一个特征［18］。

UPLC测定的化合物浓度大于所配制的浓度，推测其原因可能是实验过程中误差造成的。实验中3种物质均为二苯乙烯类化合物，结构相似，具有多个酚羟基，电子云密度比较高，在酸性条件下，不易得电子，性质较稳定。但在碱性条件下，由于具有较强的失电子能力，性质比较活泼，易被氧化成醌类物质，所以3种物质均不宜保存在碱性环境中。

3 结论

温度、光照及酸碱度这些环境因素是影响活性物质稳定性的主要因素，分别研究了温度、自然光和酸碱对白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷A稳定性的影响。结果表明，白藜芦醇在-20℃条件下可保存74.67年，氧化白藜芦醇和桑皮苷A在-40℃条件下分别可保存11.44年和3.65年。三者见光易分解，储存过程中，棕色试剂瓶可适当降低其转化和分解。储存过程中，白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷A最佳保存pH分别在3.24、5.38和4.3左右。实验结果为天然白藜芦醇、氧化白藜芦醇和桑皮苷A的生产和储存工艺提供了可用的数据参考。

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Stability analysis of three kinds of stilbene compounds in Morusalba L.

YU Yan，XIANG Wei，LIU Jun-chi，XU Li*
（College of Biotechnology，Southwest University，Chongqing 400715，China）

The factors including temperature，light，acid and alkali were used to study the stability of the three compounds.The contents of the three compounds were measured with ultra performance liquid chromatography （UPLC）.The results showed that three kinds of compounds had different period of validity in different temperatures，the resveratrol could be preserved for 74.67 years in 4℃，oxyresveratrol and mulberroside A were valid up to 11.44 years and 3.65 years in-40℃ respectively.The effect of light on the stability of mulberroside A was strongest，followed byoxyresveratrol，with weakest effect for resveratrol.The optimum pH of resveratrol，oxyresveratrol and mulberroside A were 3.24，5.38 and 4.3 respectively.These results provided effective reference for the extraction，separation，storage，transportation，utilization of the three compounds.

resveratrol；oxyresveratrol；mulberroside A；stability；ultra performance liquid chromatography

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0148-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.021

2015－05－06

喻艳（1990-），女，硕士研究生，主要从事植物化学方面的研究，E-mail：yuyan19900914@163.com。

*通讯作者：徐立（1976-），男，博士，副教授，主要从事植物化学方面的研究，E-mail：mulberry@swu.edu.cn。

中央高校基本科研业务费专项基金项目（XDJK2015C131）；重庆市研究生科研创新项目（CYS2015069）。