毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

王丹丹，周晨妍，朱新术，李同彪（.新乡医学院生命科学技术学院，河南新乡453000；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453000）

毕赤酵母工程菌发酵木聚糖酶条件的响应面优化

王丹丹1，2，周晨妍1，*，朱新术1，李同彪1
（1.新乡医学院生命科学技术学院，河南新乡453000；2.新乡医学院三全学院，河南新乡453000）

通过单因素实验研究了诱导温度、种龄、pH、甲醇浓度以及诱导时间对毕赤酵母工程菌产木聚糖酶的影响。在此基础上进行响应面优化设计实验，并根据结果拟合小二乘二次项回归方程，探讨了各因素对木聚糖酶比酶活力的影响。确定了最优的发酵培养条件：种龄为31 h，诱导时间104 h，甲醇诱导浓度1%，发酵起始pH4.0，诱导温度为30℃，在此条件下对实验结果进行验证，得到木聚糖酶比酶活力为43526.3 U/mg。

毕赤酵母，木聚糖酶，发酵条件，响应面

木聚糖酶是指专一降解木聚糖为寡木聚糖、低聚木糖、木二糖和木糖一类酶的总称［1-3］。木聚糖酶在能源、食品、饲料、造纸等工业方面有着非常重要的应用价值［4-5］。微生物发酵产木聚糖酶的过程中，不仅与微生物的种类关系密切，还与培养基的组成以及培养条件关系也非常大。木聚糖酶的生产菌有很多，包括细菌［6-8］、霉菌［5，9-10］和放线菌等，但是这些野生型菌株生产木聚糖酶存在着产量不高，酶学性质相对较差等缺点，如周薇薇等［11］利用响应面法优化了黑曲霉（Aspergillus niger FIP-09-24）的固态发酵工艺，在最佳培养条件下培养酶活力只有66002 U/g；汤文晶等使用响应面法优化匍枝根霉最高酶活力为101.697 U/mL［12］，故采用分子生物学手段对野生型木聚糖酶基因进行改造，构建工程菌是现在研究的热点，并在此基础上对工程菌发酵产酶的条件进行优化，以期获得更高产量的木聚糖酶。但是要实现工业生产，使生产菌株的发酵产值达到一个更大的水平，必须采用更为经济合理的方法进行研究。本研究在构建毕赤酵母工程菌的基础上，对其发酵条件进行进一步的优化，旨在提高木聚糖酶的的产酶量，使其在工业上有更大的应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

毕赤酵母工程菌GS115/pPIC9K-xynZF-2 新乡医学院生命科学技术学院酶与发酵工程实验室构建保存；无氨基酸酵母氮源（YNB）、G418 Amresco公司；桦木木聚糖（Birch wood xylan） Sigma公司；牛血清蛋白 上海生工生物有限公司。

恒温振荡器（HZQ-F160A） 上海一恒科学仪器有限公司；高速冷冻离心机（Neofuge 23R） 上海力申科学仪器有限公司；电子恒温水浴锅（DZKW-4）北京中兴伟业有限公司；微量分光光度计Nanodrop 2000 美国Thermo Fisher Scientific公司；往复式水浴恒温振荡器ZHWY-110X、曲线控制十段编程恒温培养箱ZGP-A2080 上海智诚分析仪器制造有限公司；不锈钢立式压力蒸汽灭菌器LX-C35L 合肥华泰医疗设备有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的配制 YPD、BMGY（生长富集培养基）、BMMY（诱导表达培养基）配制方法见参考文献［13］。

1.2.2 毕赤酵母工程菌的摇瓶培养基诱导表达 挑取保存的木聚糖酶高产菌株GS115/pPIC9K-xynZF-2，接种于含有20 mL BMGY培养基的250 mL的三角瓶中，30℃，250 r/min培养至A600为6.0左右，3000 r/min离心收集菌体，转接至装有30 mL BMMY培养基的250 mL三角瓶中，相同条件下继续培养，每24 h补加100%甲醇至终浓度为0.5%，诱导表达3 d。

1.2.3 粗酶液的制备 取诱导表达培养后的发酵液于3000 r/min离心10 min，取上清。

1.2.4 木聚糖比酶活力的测定 采用改进的DNS法［14］测定木聚糖酶活力。酶活力单位的定义：在50℃和pH4.6条件下，以0.5%桦木木聚糖作为底物，以每分钟产生1 μmol木糖所需的酶量为1个酶活力单位。以木糖作为标准样品的标准曲线为y=2.0890x-0.2079，R2=0.9999。

用Bradford法［15］测定蛋白质浓度，以牛血清白蛋白作为标准蛋白标准曲线为y=5.4200x+0.0328，R2= 0.9997。

比酶活力（U/mg）=酶活力/蛋白浓度。

1.2.5 发酵条件的单因素优化

1.2.5.1 生长曲线的绘制 挑取保存的木聚糖酶高产菌株GS115/pPIC9K-xynZF-2，接种于含有20 mL BMGY培养基的250 mL的三角瓶中，30℃，250 r/min培养48 h，每隔4 h取样一次，将菌液稀释后在波长为600 nm条件下以空白培养基为对照进行比色，测定吸光值A600，绘制细胞生长曲线，其中A600=读数×稀释倍数。

1.2.5.2 诱导温度对发酵产酶的影响 将GS115/ pPIC9K-xynZF-2，接种于含有20 mL的BMGY培养基中，30℃，250 r/min培养后接入30 mL的BMMY培养基中，于26、28、30、32、34、36℃条件下培养，每隔24 h补加0.5%甲醇一次，培养3 d后制备粗酶液，测量比酶活力，确定最优的诱导温度。

1.2.5.3 种龄对发酵产酶的影响 将GS115/pPIC9K-xynZF-2，接种于含有20 mL BMGY培养基的250 mL的三角瓶中，30℃，250 r/min培养12、16、20、24、28、 32、36 h后离心转接入30 mL的BMMY培养基中，最优温度下培养3 d，每隔24 h补加甲醇0.5%，制备粗酶液，测定比酶活力，确定最佳的种龄。

1.2.5.4 甲醇诱导时间对发酵产酶的影响 将GS115/ pPIC9K-xynZF-2接种于含有20 mL BMGY培养基的250 mL的三角瓶中，30℃，250 r/min培养，按照最佳种龄接入30 mL BMMY培养基，最适温度下继续培养，每隔24 h补加0.5%的甲醇一次，24、48、72、96、120、144、168 h后，制备粗酶液，测量比酶活力，确定最佳的诱导时间。

1.2.5.5 诱导起始pH对发酵产酶的影响 将GS115/ pPIC9K-xynZF-2接种于含有20 mL pH分别由4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的缓冲液配制的BMGY培养基中，30℃，250 r/min培养，按照最佳种龄接入30 mL 的BMMY培养基中，最适温度下培养，每隔24 h补加0.5%的甲醇一次，培养最优诱导时间后，制备粗酶液，测量比酶活力，确定最优的诱导表达起始pH。

1.2.5.6 甲醇诱导浓度对发酵产酶的影响 将GS115/ pPIC9K-xynZF-2接种于含有20 mL BMGY培养基的250 mL的三角瓶中，30℃，250 r/min培养，按照最佳种龄接入30 mL的BMMY培养基中最适温度下培养，每隔24 h补加甲醇0.25%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%，培养最优诱导时间后，制备粗酶液，测量比酶活力，确定甲醇最优的诱导浓度。

1.2.6 响应面优化设计 根据单因素实验结果，选用种龄、诱导起始pH、诱导时间、甲醇浓度为因素，采用Box-Behnken中心组合实验设计，设计四因素五水平的响应面实验，因素水平表见表1。

表1 实验因素水平表Table1 Experimental factors and levels table

1.2.7 统计学处理 每个实验进行3次重复，取其平均值，最终实验数据均用SPSS 11.0和Matlab-R2014a-Windows软件进行处理，并绘制出相应的图形。

2 结果与分析

2.1 毕赤酵母工程菌生长曲线的绘制

以培养时间为横坐标，A600为纵坐标做GS115/ pPIC9K-xynZF-2生长曲线图。如图1所示，16～36 h为对数生长期，在28 h左右菌体达到对数生长中期，对数生长期以前由于菌体刚刚开始生长，菌体含量过少，属于生长延迟期；超过对数生长期，由于菌株的代谢产物增加以及营养物质的消耗，不适宜菌体生产大量目的产物。对数生长期的菌株呈指数形式增长，繁殖速度快，菌体数量多，新陈代谢活跃，有利于进行菌株的最优化生产，所以本实验先暂定选取对数生长中期28 h菌体作为发酵用种子。

图1 毕赤酵母工程菌生长曲线图Fig.1 Growth curve of recombinant yeast

2.2 单因素实验

2.2.1 诱导温度对发酵产酶的影响 图2显示，在低于30℃时，随着温度的上升，该工程菌的产酶量依次增加，并且在30℃时产酶量达到最大，温度再次升高时，产酶量成下降趋势。温度是微生物菌体生长的重要环境条件之一，菌体的发酵过程就是菌体内酶反应的一个过程，酶反应需要一定的温度。温度是通过影响微生物膜的液晶结构、酶和蛋白质的合成与活性，以及RNA的结构和转录等影响微生物的生命活动［16］。温度过低，微生物的生长素受到限制，表达过程也会受到影响；温度过高会破坏微生物的生长和表达过程，因此选择合适的温度非常重要，对于该工程菌选择诱导温度为30℃。

图2 温度对工程菌发酵产酶的影响Fig.2 Effect of temperature on xylanase production

2.2.2 种龄对发酵产酶的影响 将GS115/pPIC9K-xynZF-2进行甲醇诱导表达，并对其发酵条件进行优化。在发酵过程中，种子的选择非常关键，种龄太短，发酵过程会出现前期生长缓慢，致使周期延长，甚至造成异常发酵；种龄过长，会引起菌体过早自溶，导致生产能力下降。图3结果显示种龄选择在对数生长期的28 h（A600=16.0）时，比酶活力最高。

2.2.3 甲醇诱导时间对发酵产酶的影响 图4结果表明，诱导表达前期随着时间的延长，表达量增大，在诱导96 h时达到最大；之后随着时间的延长，产酶量依次递减。在毕赤酵母中蛋白表达后被分泌到细胞外，可能影响培养液中营养物质的pH进而影响木聚糖酶的表达。诱导时间过短时，诱导剂还未充分发挥作用，培养基中营养物质并未大量消耗，启动子启动转录，蛋白表达量较少，比酶活力较低；诱导时间过长，培养液pH会发生明显改变，并且随着营养物质的大量消耗，目的蛋白的表达将会受阻，导致发酵液比酶活力下降。因此选择96 h为该工程菌的最佳诱导时间。

图3 种龄对产酶的影响Fig.3 Effect of inoculation time on xylanase production

图4 甲醇诱导时间对产酶的影响Fig.4 Effect of induction time on xylanase production

2.2.4 发酵起始pH对产酶的影响 图5结果显示，发酵液偏酸偏碱都会影响工程菌的表达。GS115/ pPIC9K-xynZF-2工程菌在pH为6.5时产酶量最高，pH偏高时，毕赤酵母自身分泌的蛋白酶活力较高，可以分解产生的木聚糖酶［17］；pH偏低时，酸性太强，重组木聚糖酶非常的不稳定，所以该工程菌的发酵pH应选择在pH6.5。

图5 发酵起始pH对产酶的影响Fig.5 Effect of pH on xylanase production

2.2.5 诱导浓度对产酶的影响 甲醇能够诱导重组毕赤酵母表达，但是并不是随着甲醇浓度的增加表达量就随之增加，图6结果表明，甲醇浓度在1.5%时诱导表达量最大，浓度过大对诱导表达反而起抑制作用。毕赤酵母的表达是以醇氧化酶启动子启动外源基因表达的，在只有甘油作为碳源的BMGY培养基中，甲醇氧化酶AOX1根本不会产生，外源基因也不会表达［18］。在以甲醇作为碳源的BMMY培养基中，一方面，毕赤酵母会表达醇氧化酶来利用甲醇，而木聚糖酶基因在醇氧化酶基因的下游，所以木聚糖酶的表达与醇氧化酶的表达成正比关系；另一方面，甲醇既可以作为酵母的碳源也可以作为诱导物，因此，在一定范围内提高甲醇的浓度可能会增加外源蛋白的表达量，但是，添加过量，甲醇对酵母生长也会产生毒害作用，由图6可以选择1.5%为该工程菌的最优甲醇浓度。

图6 甲醇浓度对产酶的影响Fig.6 Effect of methanol concentration on xylanase production

2.3 响应面实验设计优化结果

2.3.1 方差分析 如表2所示是响应面的结果，使用Matlab软件对结果进行统计学分析，对表中数据我们进行了方差分析，见表3，在误差允许范围内，F值大于临界值，四个因素的影响是显著的，具有统计学意义。

对表中结果选用偏最小二乘回归分析程序进行分析，得到毕赤酵母工程菌发酵产木聚糖酶比酶活力（Y）对种龄（X1）、诱导时间（X2）、甲醇浓度（X3）、pH （X4）的二次多项式回归模型：Y=6672.3+1663.8X1-1222.3X3-1017.2X4+876.9X+1540X+759.2X-1670X1X3-1043.8X1X4-1560.2X2X3。可以从误差平方和看出该二次多项式回归模型的拟合效果，当潜变量个数为1时，数据标准化后模型误差平方和为0.7526，并且可以得出相应组分时的模型拟合决定系数R2为0.9465，回归模型的拟合度较好。

表2 响应面分析实验结果Table2 Results of response surface analysis test

图7 响应面结果四维图Fig.7 Four dimensional graph of response surface results

表3 方差分析Table3 Analysis of variance

基于该模型，可以以四维图的形式显示出来，如图7所示，从图7中可以看出，四个因素在不同的水平对比酶活力均能产生不同的影响，最大值处于四维图的边缘，这给后期做进一步的优化提供了很好的基础。根据设定的条件对回归模型进行优化，在一定的实验范围内可以通过寻优得到最优的发酵工艺条件为：种龄为31 h，诱导时间104 h，甲醇诱导浓度1%，发酵起始pH4.0，模拟结果如图8所示。根据此回归方程可以得到最优比酶活力可达44279 U/mg。

图8 模拟结果四维图Fig.8 The four dimensional map of analog result

2.3.2 验证性实验 根据所得到的最优发酵工艺条件进行验证性实验，重复3次，得到实际比酶活力为43526.3 U/mg，大概占预测值的98.3%，说明此回归模型很好地反应了实际情况。

3 结论

通过对毕赤酵母工程菌发酵条件单因素的优化，确定各个因素的最优水平，在此基础上进行Box-Behnken实验设计，对工程菌发酵产木聚糖酶的发酵条件进行优化，以小二乘模型对实验数据进行优化，得到影响木聚糖酶比酶活力的二次多项式回归方程。最终的最优发酵工艺条件为种龄为31 h，诱导时间104 h，甲醇诱导浓度1%，发酵起始pH4.0，预测值为44279 U/mg，对实验结果进行验证性实验，最终实际数值为43526.3 U/mg，与理论数值相差不大说明该回归模型合理可靠，与优化前比酶活力1180 U/mg（图2，30℃条件下培养）相比提高了36倍多。本实验是在实验室水平上进行的，后续研究可以考虑对发酵罐中试等扩大培养条件进行优化，以使该结果在工业上得到更大的利用。

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Optimization of fermentation condition of Pichia pastoris for xylanase production by response analysis

WANG Dan-dan1，2，ZHOU Chen-yan1，*，ZHU Xin-shu1，LI Tong-biao1
（1.School of Life Science and Technology，Xinxiang Medical University，Xinxiang 453000，China；2.San Quan Medlcal College，Xinxiang 453000，China）

The influence of the temperature，inoculum time，pH，methanol concentration and induction time on the xylanase production of pichia recombinant bacteria were studied.The response surface optimazation was designed on the basis of the single factor experiment，and the small squares quadratic regression equation was fitted out according to the results to discuss the influence of the various factors on the xylanase enzyme activity.The optimum fermentation culture conditions were as follows:inoculum age 31 h，induction time 104 h，methanol concentration induced by 1%，fermentation starting pH4.0，induction temperature 30℃.On this condition，the result of the experiment for xylanase enzyme activity was 43526.3 U/mg.

Pichia pastoris；xylanase；fermentation conditions；response surface

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0194-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.031

2015－05－06

王丹丹（1988-），女，硕士研究生，助教，研究方向：微生物酶工程，E-mail：wangdan2988@126.com。

*通讯作者：周晨妍（1979-），女，副教授，研究方向：酶工程与发酵工程，E-mail：zhouchenyan2008@163.com。

河南省教育厅科学技术研究重点项目（13A180861）；河南省高等学校青年骨干教师资助计划项目（2011GGJS-125）；新乡医学院科研项目培育基金（2013ZD113）；新乡医学院研究生科研创新支持计划项目资助（YJSCX201327Y）。