超高压协同磷酸盐对虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶特性的影响

王诗萌，张坤生，任云霞（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学食品工程系，天津300134）

超高压协同磷酸盐对虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶特性的影响

王诗萌，张坤生*，任云霞
（天津市食品生物技术重点实验室，天津商业大学食品工程系，天津300134）

为了提高虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶的品质，优化加工工艺，把磷酸盐（STP）添加到虾蛄肌原纤维蛋白中，然后经超高压处理，加热形成凝胶，测定其凝胶强度。结果表明，STP对肌原纤维蛋白凝胶的凝胶强度影响极显著（p＜0.01）。通过Box－Behnken实验所得的结果和二次多项回归方程确立了最优的工艺条件，即：压力为293 MPa，保压时间为17 min，STP添加量为6.0%，得到凝胶强度为（214.340±4.93）g。STP与保压时间的交互作用对蛋白凝胶强度影响显著（p＜0.05），其他因素交互作用并不显著（p＞0.05）。研究表明，超高压协同磷酸盐能够促进肌原纤维蛋白形成良好的凝胶，在虾蛄肉制品加工中具有广泛的应用前景。

虾蛄，肌原纤维蛋白，超高压，磷酸盐，凝胶性质

虾蛄（Oratosquilla oratoria）俗称皮皮虾、虾爬子、琵琶虾，分布范围广，营养丰富。随着人们生活水平的提高，膳食结构逐步完善，消费者对虾蛄的需求量越来越高，但其具有强季节性，对生存环境的盐度、pH、水温、光照等条件要求严格，将虾蛄制成成品或半成品可缓解供需矛盾［1-2］。

肌原纤维蛋白（MP）的凝胶特性是影响肉制品的质构、保水性、感官特性及乳化性的重要因素［3］，MP属于盐溶性蛋白，影响其功能特性的因素主要包括内在因素和外在因素，内在因素主要指的是蛋白质种类不同、来源不同、含量及结构不同等，外在因素主要指pH、离子强度、压强、温度、蛋白浓度等［4-7］。目前，越来越多的研究［8］开始利用磷酸盐来改善蛋白质特性，由于引进大量的磷酸根，因而改变了蛋白质的等电点、溶解度等，并改变了蛋白质分子的交联特性，影响了凝胶强度及保水性。

超高压技术（ultra-high pressure，UHP）是在室温或温和加热条件下利用100～1000 MPa的压力处理食品以达到杀菌钝酶和加工食品的目的。超高压处理蛋白质会改变其分子构象，从而改变蛋白质的许多功能特性，包括乳化性、凝胶性等，其作用效果取决于蛋白质种类、结构、压力及处理时间等［9］。刘红芝等［10］报道对蛋白质加压处理能够使其形成稳定的凝胶。SUN等［11］研究表明，超高压处理可以增加肌原纤维蛋白的溶解性，有利于提高或者保持蛋白质的凝胶特性。Anita L Sikes等［12］利用超高压研究牛肉香肠，显示高压能够增加蛋白质之间的凝聚性和凝胶特性，从而使香肠的蒸煮流失率下降，改善了香肠的质构。

将超高压与磷酸化这两种处理手段结合使用在国内外还是比较少见，本实验研究了超高压协同磷酸盐对虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶的强度影响，并通过响应面方法优化肌原纤维蛋白凝胶加工工艺，得出虾蛄中肌原纤维蛋白加工的最佳工艺，旨在为虾蛄制品的开发提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

虾蛄 购自天津市北辰区老板娘水产城；EDTA分析纯，天津市佳兴化工玻璃仪器工贸有限公司；NaH2PO4、Na2HPO4分析纯，天津市北方天医化学试剂厂；NaCl分析纯，天津市风船化学试剂科技有限公司；三聚磷酸钠（STP） 分析纯，天津市光复精细化工研究所；MgCl2分析纯，天津市天大化工实验厂。

STEPHAN UMC5斩拌机 德国STEPHAN公司；Avanti J-E高效离心机 美国BECKMAN公司；IKA T10高速组织匀浆机 德国IKA公司；HH-42恒温水浴锅 常州国华电器有限公司；FA2004A电子天平上海精天仪器有限公司；SMSTA TA-XT Plus质构仪英国Stable Micro System公司；UV-7504紫外可见分光光度计 上海欣茂仪器有限公司；HPP.L2-800/ 2.5超高压设备 天津市华泰森淼生物工程技术有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 肌原纤维蛋白提取 参照Xiong［13］的方法并改进，虾蛄去头去尾去壳取肉，加入4倍体积的蛋白提取液（0.1 mol/L NaCl、0.002 mol/L MgCl2、0.001 mol/L EDTA、0.1mol/L NaH2PO4/Na2HPO4缓冲溶液pH=7.0），高速匀浆25 s，高速冷冻离心机离心（5000 r/min，15 min，4℃），弃上清液留沉淀，再加入蛋白提取液重复上述操作两次得粗蛋白，将所得粗蛋白与4倍体积的0.1 mol/L NaCl溶液混合，高速匀浆25 s，冷冻离心（5000 r/min，15 min，4℃）3次，最后一次离心前将混合液的pH调至6.25，弃上清液，沉淀为虾蛄中肌原纤维蛋白。

1.2.2 单因素实验

1.2.2.1 不同压力处理 将MP稀释到50 mg/mL，加入STP的量为MP含量的6.0%，搅拌均匀后在30℃水浴中加热2 h，将包装好的磷酸化肌原纤维蛋白溶液放入高压腔体内，压力水平分别设为0、200、400、600 和800 MPa，温度25℃，保压时间15 min，对照组为未经高压处理的样品。

1.2.2.2 不同保压时间处理 将MP稀释到50 mg/mL，加入STP的量为MP含量的6.0%，搅拌均匀后在30℃水浴中加热2 h，将包装好的磷酸化肌原纤维蛋白溶液放入高压腔体内，压力水平设为400 MPa，温度25℃，保压时间分别设定为5、10、15、20和25 min。

1.2.2.3 不同添加量STP处理 将MP稀释到50 mg/mL，加入STP的量设定为MP含量的0%、3%、6%、9%、12%，搅拌均匀后在30℃水浴中加热2 h，将包装好的磷酸化肌原纤维蛋白溶液放入高压腔体内，压力400 MPa、温度25℃、保压时间15 min。

1.2.2.1 ～1.2.2.3的样品处理重复三次，每份取20 mL置于40 mL的小烧杯中，在20℃水浴锅中以1℃/min的速度梯度升温加热至70℃，迅速从水浴锅中将试样取出，快速冷却至4℃，并在4℃冰箱中存放8～12 h，进行蛋白凝胶强度的测试。

1.2.3 响应面实验设计 本研究采用Box-Behnken模型，以压力水平、STP的质量分数和保压时间3个因子为自变量，分别以A、B、C来表示，并以+1、0、-1分别代表自变量的高、中、低水平［14］。因素水平及编码见表1。

表1 响应面实验因素水平及编码Table1 Factor level and coding of RSM experiment

本研究以样品中的凝胶强度（Y）作为评价指标（响应值），就凝胶肉类制品而言，其强度越大，产品品质越好。

1.3 检测方法

1.3.1 蛋白质含量测定 参照才卫川等［15］的方法进行蛋白含量标准曲线的绘制及蛋白含量的测定。

1.3.2 凝胶强度的测定 将凝胶样品取出，在室温下放置20 min，用TA-XT Plus型质构分析仪测试凝胶的强度。探头型号：P/0.5；测前速度：1.0 mm/s；测试速度：0.5 mm/s；测后速度：1.0 mm/s；测试距离：7.0 mm；触发类型：自动；触发力：5.0 g，每个样品做3组平行。

1.4 数据处理

采用SPSS 19.0、Excel 2007、OriginPro 8.5、Design expert 8.0.4进行数据处理。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 压力水平对MP凝胶强度的影响 由图1可知，随着压力的增加，蛋白质的凝胶强度先增加后减小，当压力为400 MPa时，蛋白凝胶强度最大为140.08 g。这可能是由于高压影响了分子间的相互作用和蛋白质的构象，导致蛋白质的变性和聚集［16］。当压力超过400 MPa时，蛋白质凝胶强度随着压力增加而减小，陆海霞等［17］认为这是由于压力的增加，导致蛋白质的结构发生改变，其α-螺旋和β-折叠含量会逐渐下降，而α-螺旋结构正是维持蛋白质网状结构的主要构象。

图1 压力水平对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响Fig.1 Effect of pressure level on gel strength of gel myofibril protein gel

2.1.2 保压时间对MP凝胶强度的影响 由图2可知，蛋白质的凝胶强度随保压时间的延长先增大后减小，当保压时间为15 min时，凝胶强度最大，汪之和［18］曾报道这是由于压力的作用可以改变蛋白质分子的结构，蛋白分子内部的极性基团和疏水基团可以充分的暴露，但当保压时间过长，则会导致α-螺旋会减少，蛋白质变性程度增大，凝胶强度减弱。

图2 保压时间对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响Fig.2 Effect of holding pressure time on gel strength of gel myofibril protein gel

2.1.3 STP添加量对STP-MP凝胶强度的影响 由图3可知，随着STP添加量的增加，STP-MP的凝胶强度呈现先增大后减小的趋势，且趋势显著（p＜0.05），当STP添加量为MP含量的6%时，凝胶强度达到峰值。尚永彪等［19］曾报道可能是由于添加STP使蛋白质与水分子间亲和作用增加，蛋白质与蛋白质之间的排斥力增加，相互亲和与聚集作用力减小，蛋白质浊度减小，溶解度增加，从而加大了蛋白质与蛋白质、蛋白质与多肽之间碰撞的机会，使得凝胶网络结构更加紧密。

图3 STP对肌原纤维蛋白凝胶强度的影响Fig.3 Effect of STP on gel strength of gel myofibril protein gel

2.2 响应面分析结果

在单因素实验基础上，响应面实验设计及结果如表2。

表2 实验设计及结果Table2 Design and results of the experiment

根据表2的结果，利用Design expert 8.0.4统计软件对实验数据进行多元回归拟合，得到拟合模型：

对该回归方程进行方差分析，由表3方差分析可看出：p＜0.0001＜0.01表明回归方程极显著，不同处理组的差异极显著；而失拟项的p=0.1809＞0.05，故其不显著；而且该模型的决定系数R2=0.9530，说明它能解释95.30%响应值（凝胶强度）的变化规律，仅有总变异的4.70%，不能用此模型来解释，因此该方程拟合程度良好，实验误差较小，可以用来对肌原纤维蛋白的凝胶强度进行分析和预测。由p值可知，方程中C、BC、A2、B2、C2对Y值有显著性的影响，表明实验因子对响应值的影响不是单纯的线性关系，而实验因子BC之间的交互作用及二次项对响应值也有很大的影响。

根据回归方程，作出响应面立体图，结果见图4～图6。从响应面的最高点可以看出，在所选择的范围之内，响应值（Y）存在最高点，即极值。

由图4可以看出，当STP含量不变时，在不同保压时间条件下随着压力的增加，蛋白质凝胶强度先增加后减小。在保压时间15 min左右、压力350 MPa左右能得到较大的响应值，压力较大或者保压时间过长均会使蛋白凝胶强度下降，但是二者间的交互作用对蛋白凝胶强度影响不显著（p＞0.05）。

表3 回归模型方差分析Table3 Variance analysis of regression model

图4 压力与保压时间交互影响凝胶强度的曲面图Fig.4 The surface chart of pressure and holding pressure time on gel strength

图5 压力与STP交互影响凝胶强度的曲面图Fig.5 The surface chart of pressure and STP on gel strength

由图5可知，当保压时间不变，在不同压力条件下，蛋白凝胶强度随着STP含量的增加先增大后减小，在不同STP含量条件下，蛋白凝胶强度随着压力条件的增加也是先增加后减小，在压力300 MPa、STP含量为6.5%左右能达到较大的响应值，但STP含量与压力的交互作用对蛋白凝胶强度影响不显著（p＞0.05）。

由图6可知，当压力不变，在不同保压时间条件下，蛋白凝胶强度随着STP含量的增加先增大后减小，保压时间越长，增幅就越大，在较高STP添加量及较长保压时间条件下能得到较大的响应值，即较大的蛋白凝胶强度，STP含量与压力的交互作用对蛋白凝胶强度影响显著（p＜0.05）。

图6 保压时间与STP交互影响凝胶强度的曲面图Fig.6 The surface chart of holding pressure time and STP on gel strength

由表3中的p值可知，以上三个因素对虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶强度影响从大到小依次为：C（STP含量）＞B（保压时间）＞A（压力），即STP含量对虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶强度的影响最为显著。利用Design expert 8.0.4软件可得各个因素的最佳条件组合为STP含量为6.0%、压力为293.44 MPa、保压时间为16.72 min，在此条件下，凝胶强度可达到217.903 g。为了检验模型预测的准确性，将软件所得结果进行修正，结果为STP含量为6.0%、压力为293 MPa，保压时间为17 min，在此添加量的条件下，做3组平行实验所得结果为（214.340±4.93）g，误差为4.03%，由此可得，采用响应面分析法对虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶特性的优化是行之有效的。

3 结论

本实验在单因素实验基础上通过响应面法优化了虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶的制备工艺，响应值设定为蛋白凝胶强度。实验表明：STP添加量、保压时间与STP添加量的交互作用、压力水平的平方项、保压时间的平方项、STP添加量的平方项对蛋白质凝胶强度具有显著性（p＜0.05）影响。并得到虾蛄中肌原纤维蛋白凝胶制备的最佳工艺：压力为293 MPa，保压时间为17 min，STP添加量为6.0%，此时凝胶强度为（214.340±4.93）g。

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Effects of polyphosphate and high pressure processing treatment on the characteristics of squilla myofibrillar protein gel

WANG Shi-meng，ZHANG Kun-sheng*，REN Yun-xia
（Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology，Department of Food Engineering，Tianjin University of Commerce，Tianjin 300134，China）

In order to improve the quality of myofibrillar protein gel and optimize the processing technology，STP was added to the myofibrillar protein solution，flowing by ultra high pressure processing.Gel strength was measured after heating into gel.The results showed that the effect of STP on the gel strength of myofibrillar protein gel was significant（p＜0.01）.The results of Box Behnken test and two multiple regression equation to establish the optimal process conditions:pressure of 293 MPa，holding time of 17 min，the addition of STP was 6.0%.The strength of myofibrillar protein gel under this condition was（214.340±4.93）g.Interaction of STP and pressure holding time was significant（p＜0.05），but the interaction between other factors was not significant （p＞0.05）.Research showed that STP and ultra high pressure could promote the formation of good combination of myofibrillar protein gel，which had the widespread application prospect in the squilla products processing.

squilla；myofibrillar protein；ultra-high pressure（UHP）；posphorylation；gel characteristics

TS251.1

B

1002-0306（2016）02-0234-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.039

2015－05－06

王诗萌（1991-），女，硕士研究生，研究方向：食品加工与贮藏，E-mail：wsm6523@163.com。

*通讯作者：张坤生（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品加工与贮藏，E-mail：zhksheng@tjcu.edu.cn。

国家科技支撑计划项目（2012BAD37B06-07）。