响应面法优化盘龙七中岩白菜素的提取工艺

王 星，赵 桦，马英丽，杨秋琛，陈晓玲（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

响应面法优化盘龙七中岩白菜素的提取工艺

王 星，赵 桦*，马英丽，杨秋琛，陈晓玲
（陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中723000）

为优化盘龙七药材中岩白菜素的超声提取工艺，在单因素实验的基础上，利用响应面分析方法建立了盘龙七岩白菜素的超声提取功率、超声提取时间、乙醇浓度和提取温度的二次响应曲面方程。结果表明，对盘龙七岩白菜素提取率影响的大小次序为：超声提取温度、超声功率、乙醇浓度和超声提取时间。盘龙七岩白菜素超声提取工艺的最佳条件为：提取温度为59℃、超声功率270 W、乙醇浓度75%，提取时间40 min/次，料液比1∶30，提取3次，在此条件下盘龙七岩白菜素得率为6.429%，与模型预测值6.432%高度相符。

盘龙七，岩白菜素，超声提取，响应面分析法

盘龙七（Rhizoma Bergeniae Scopulosae），为虎耳草科（Saxifragaceae）岩白菜属植物秦岭岩白菜（Bergenia scopulosa T P Wang）的根茎，多年生草本，分布于陕西秦岭西段及甘肃东南部，生于海拔2500～3600 m的林下阴湿处或峭壁石隙，为我国特有种［1-2］。盘龙七是陕西民间常用药，有补脾健胃，收涩固肠，除湿利水，活血之功效。临床上用于治疗急慢性肠胃炎、浮肿、崩漏、白带、淋症、痢疾、黄水疮、秃疮、疥癣等［3］。研究报道，盘龙七含有较为丰富的岩白菜素（Bergenin），现代医学研究表明，岩白菜素具有良好的镇咳和治疗胃肠道疾病的功效，如胃溃疡、腹泻及便秘，此外还具有良好的抗炎、抗心律失常、抗病毒、护肝等作用［4-6］。

超声提取法近年来已广泛用于天然产物中有效成分的提取，该方法也有用于植物中岩白菜素提取的研究报道［7-11］。响应面分析法（Response surface analysis，RSA）是利用合理的实验设计，采用多元二次回归方程来拟合因素与响应值之间的函数关系，以回归分析寻求最优工艺的有效方法，已广泛应用在中药有效成分提取工艺等诸多工艺过程优化控制等领域［12-16］，但使用响应面法优化盘龙七药材中岩白菜素提取工艺的研究尚未见报道。本文以甘肃省陇南市文县产盘龙七为原材料，采用超声波辅助提取法，通过单因素实验，分析比较提取分离过程中各因素对岩白菜素提取的影响，利用响应面分析法优化其岩白菜素提取工艺。研究结果将丰富对盘龙七药材的应用研究的积累，同时也为岩白菜属植物资源的开发利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

盘龙七 产自甘肃省陇南市文县，经汉中药检所彭强主任药师鉴定为秦岭岩白菜干燥根茎，即盘龙七药材；岩白菜素对照品 购自上海同田生物技术股份有限公司；乙腈 色谱纯，天津市光复精细化工研究所生产；乙醇、磷酸 分析纯，西安化学试剂厂生产；水 为自制超纯水。

Waters e2695高效液相色谱仪、Empower色谱工作站 美国Waters公司；U-3900H紫外分光光度计日本日立公司；AB204-S电子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；KQ-300DE型数控超声波清洗机 昆山市超声仪器有限公司，UPH-II-10T优普超纯水机 成都优普净化科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 盘龙七中岩白菜素的提取 取盘龙七药材→在60℃条件下烘干→粉碎过60目筛→称取约1.0 g，精密称定→超声辅助提取→滤过→定容→放于4℃冰箱中备用。

1.2.2 岩白菜素含量的测定

1.2.2.1 标准曲线的建立 精密称取岩白菜素对照品7.5 mg，用甲醇定容至100 mL棕色容量瓶中，配制成75 μg/mL（母液）的对照品溶液。准确量取岩白菜素标准品母液2、4、6、8 mL，分别用无水甲醇定容至10 mL的棕色容量瓶中，配制成浓度分别为15、30、45、60 μg/mL的岩白菜素标准品溶液，加上岩白菜素标准品母液共五种不同浓度的溶液分别进样，每个浓度分别进样三次，每次进样10 μL，进样前用0.45 μm的滤膜过滤，测定峰面积，以岩白菜素标准品溶液浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

1.2.2.2 样品测定 HPLC法分析盘龙七中岩白菜素的色谱条件为：色谱柱为Inertsil ODS-3C18（4.6 mm×150 mm，5 μm）柱，以乙腈-0.2%磷酸溶液（9∶91）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长275 nm，柱温30℃。按1.2.2.1的方法测定样品供试液，根据岩白菜素标准曲线，按下式计算样品中岩白菜素得率：

式中，C代表供试品溶液的浓度（g/mL），V代表供试品溶液的总体积（mL），M代表所称取盘龙七药材的量（g）。

1.2.3 单因素实验设计 以岩白菜素得率为考察指标进行评价和分析，分别考察超声提取功率、料液比、提取溶剂乙醇浓度、提取温度、提取次数、提取时间6个因素对盘龙七中岩白菜素提取得率的影响，筛选其中4个对岩白菜素得率影响较大的因素，确定其最佳参数作为响应面分析因素。

1.2.3.1 超声功率对岩白菜素得率的影响 以1∶30为料液比，60%的乙醇为溶剂，在50℃的条件下，分别将功率设为180、210、240、270和300 W五个梯度，超声提取三次，每次30 min，按1.2.1方法测定得率，每组实验重复三次。

1.2.3.2 料液比对岩白菜素得率的影响 以240 W做为超声提取功率，以60%的乙醇为溶剂，在50℃条件下，分别将料液比设置为1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40五个梯度，超声提取三次，每次30 min，按1.2.1方法测定得率，每组实验重复三次。

1.2.3.3 乙醇浓度对岩白菜素得率的影响 以240 W做为超声提取功率，料液比为1∶30，在50℃条件下，分别将乙醇浓度设置为50%、60%、70%、80%和90%五个梯度，超声提取三次，每次30 min，按1.2.1方法测定得率，每组实验重复三次。

1.2.3.4 提取温度对岩白菜素得率的影响 以240 W做为超声提取功率，料液比为1∶30，以60%的乙醇为溶剂，分别将提取温度设置为40、50、60、70和80℃五个梯度，超声提取三次，每次30 min，按1.2.1方法测定得率，每组实验重复三次。

1.2.3.5 提取次数对岩白菜素得率的影响 以240 W做为超声提取功率，料液比为1∶30，以60%的乙醇为溶剂，分别将提取次数设为1次、2次、3次和4次四个梯度，在50℃条件下，超声提取三次，每次30 min，按1.2.1方法测定得率，每组实验重复三次。

1.2.3.6 提取时间对岩白菜素得率的影响 以240 W做为超声提取功率，料液比为1∶30，以60%的乙醇为溶剂，分别将时间设为20、30、40、50和60 min五个梯度，在50℃条件下，超声提取三次，按1.2.1方法测定得率，每组实验重复三次。

1.2.4 响应面实验设计 在单因素实验的基础上，固定超声提取次数为3次，料液比为1∶30，采用响应面分析法，根据Box-Behnken的中心组合原理选取超声功率（A）、提取时间（B）、乙醇浓度（C）、提取温度（D）共4个对岩白菜素提取影响显著的因素，以盘龙七岩白菜素得率为响应值，进行响应面实验。实验设计如表1。

表1 响应面分析因素与水平Table1 Variables and levels in response surface design

1.3 数据处理

所有的实验均重复3次，利用统计分析软件Design expert 8.0.6及Excel程序对实验结果进行分析。

2 结果与分析

2.1 标准曲线的建立

按1.2.2项下方法，得岩白菜素的回归方程为：Y= 14942X-428.60（R2=0.9998），表明在15.0～75.0 μg/mL范围内呈良好的线性关系，标准曲线图见图1，标准品色谱图见图2，供试品色谱图见图3。

图1 岩白菜素标准曲线图Fig.1 Standard curve of bergenin

图2 岩白菜素标准品色谱图Fig.2 Standard chromatogram of bergenin

图3 岩白菜素供试品色谱图Fig.3 Test sample chromatogram of bergenin

2.2 单因素实验结果

图4 超声功率对岩白菜素得率的影响Fig.4 Effect of ultrasonic power on yield of bergenin

2.2.1 超声功率对岩白菜素得率的影响 由图4可以看出，在其他条件不变的情况下，随着超声功率的增加，岩白菜素的得率呈上升趋势，当达到240 W时，得率达到最大值。从240～270 W趋势变得平缓，当再增大功率（270～300 W）后，岩白菜素得率又逐渐减小，这可能是由于随着超声功率的增加部分岩白菜素结构遭到破坏所致。

2.2.2 料液比对岩白菜素得率的影响 由图5可以看出，在其他条件不变的情况下，随着料液比的增大（1∶20～1∶30），得率呈上升趋势，当料液比继续增大时（1∶30～1∶40），随着料液比的增大，岩白菜素得率上升趋势变得平缓，表明料液比大约为1∶30时，药材中的岩白菜素绝大部分已被提取出，增大料液比虽能充分提取岩白菜素，但考虑提取成本，确定料液比为1∶30。

图5 料液比对岩白菜素得率的影响Fig.5 Effect of solid-liquid ratio on yield of bergenin

2.2.3 乙醇浓度对岩白菜素得率的影响 由图6可以看出，在其他条件不变的情况下，随着乙醇浓度的增大（50%～70%），岩白菜素得率呈不断上升趋势，当浓度达到约70%左右时岩白菜素得率达到最大值，随着乙醇浓度的继续增大岩白菜素得率呈下降趋势，表明岩白菜素在乙醇浓度大约为70%时，溶解度达到最大。

图6 乙醇浓度对岩白菜素得率的影响Fig.6 Effect of ethanol concentration on yield of bergenin

2.2.4 提取温度对岩白菜素得率的影响 由图7可以看出，在其他条件不变的情况下，随着提取温度的升高（40～60℃），岩白菜素得率呈上升趋势，当温度达到60℃左右时，岩白菜素得率达到最大，随着温度的继续升高（60～80℃），岩白菜素得率呈不断下降趋势，此现象说明提取岩白菜素的最适温度大约为60℃。产生此现象的原因可能是随着温度的继续升高（60～80℃），提取液中部分岩白菜素分解所致。

2.2.5 提取次数对岩白菜素得率的影响 由图8可以看出，在其他条件不变的情况下，随着提取次数的增加（1～3次），岩白菜素得率呈不断上升趋势，随着提取次数的再次增加（3～4次），岩白菜素得率基本呈平缓趋势，此现象表明，提取3次和提取4次所得到的结果基本相同，考虑到生产实际，选取提取3次为宜，以节省提取溶剂和时间。

图7 提取温度对岩白菜素得率的影响Fig.7 Effect of extraction temperature on yield of bergenin

图8 提取次数对岩白菜素得率的影响Fig.8 Effect of the number of repeated extraction on yield of bergenin

2.2.6 提取时间对岩白菜素得率的影响 由图9可以看出，在其他条件不变的情况下，随着提取时间的增加（20～40 min），岩白菜素得率呈不断上升趋势，当提取时间大约为40 min时，岩白菜素得率达到最大值，随着提取时间的再增加（40～60 min），岩白菜素得率呈不断下降趋势，这可能是因为随着提取时间的再增加（40～60 min），进入到提取剂中的岩白菜素由于过长时间的超声振荡和加热等原因而导致部分岩白菜素被分解。

图9 提取时间对岩白菜素得率的影响Fig.9 Effect of extraction time on yield of bergenin

在以上单因素实验考察的6个因素中，超声功率、提取温度、乙醇浓度和提取时间4个因素对岩白菜素得率的影响较明显，随着超声功率增加、温度提高、乙醇浓度加大和提取时间延长，都会使岩白菜素的得率由小到大，达到最大值后，又再减小。而料液比和提取次数2个因素对岩白菜素得率的影响不同，随液料比和提取次数增加，岩白菜素得率由小到大，达到最大后，再增加液料比和提取次数时其得率基本保持稳定，不会明显降低。因此，在做本响应面实验时，选择对岩白菜素得率影响明显的4个因素进行优化实验，而料液比和提取次数则选择最佳条件为基本因素。

2.3 响应面实验结果与分析

表2 响应面分析方案及实验结果Table2 Arrangement and experimental results of response surface central composite design

2.3.1 二次回归模型拟合及方差分析 利用软件Design Expert 8.0.6的Box-Behnken中心组合设计，对超声功率、提取时间、乙醇浓度、提取温度进行响应面实验，实验结果见表2。对表2数据进行回归分析，得到超声提取功率（A），超声提取时间（B），乙醇浓度（C），超声提取温度（D）的二次多项式回归方程：

表3 回归方程各项的方差分析表Table3 ANOVA（analysis of variance）of tems of regression equation

从表3可以看出，用上述回归方程描述各因素与响应值的关系时，其因变量和全体自变量之间的线性关系显著（r=模型平方和/总离差平方和=0.9787），模型的显著水平p＜0.0001，说明此模型高度显著，与实际实验拟合良好，实验误差小，该实验方法可靠。回归方程各项方差分析，当显著水平小于0.05时，它所对应的条件对响应值的作用是显著的，方程的失拟误差不显著，可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。结果表明，A、B、C、D、AB、AC、AD、CD、A2、B2、C2、D2对实验结果影响显著。因此，各实验因子对响应值的影响不是线性关系。对盘龙七岩白菜素得率影响的大小依次为提取温度＞超声功率＞乙醇浓度＞提取时间，即超声提取温度对岩白菜素得率的影响最为显著。

2.3.2 响应面分析与优化 通过响应面二次多项模型方程的建立，得到回归优化响应面曲面图，如图10～图13所示。

由图10可知，超声功率与乙醇浓度交互作用的响应曲面陡峭，表明两者对岩白菜素得率的影响非常显著。当提取功率较小，乙醇浓度较低时，得率较低。之后随着超声提取功率和提取温度的提高，得率也随之提高。在超声功率达到240 W，乙醇浓度到达70%时，响应值应值达到最高点，即得率最高。

图10 超声功率和乙醇浓度对岩白菜素得率的影响Fig.1 0 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and ethanol concentration on yield of bergenin

图11 超声功率和提取温度对岩白菜素得率的影响Fig.1 1 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and extraction temperature on yield of bergenin

由图11可知，超声功率与提取温度交互作用的响应曲面陡峭，表明两者对岩白菜素得率的影响非常显著。当提取功率较小，提取温度较低时，得率较低。之后随着超声提取功率和提取温度的提高，得率也随之提高。在超声功率达到240 W，提取温度到达60℃时，响应值达到最高点，即得率最高。

由图12可知，提取温度和乙醇浓度交互作用的响应曲面较为陡峭，等高线图表明两者的交互作用影响比较显著，特别是提取温度的变化对岩白菜素得率的影响明显，随着温度的升高，得率增加比较明显。相比之下，乙醇浓度对得率的影响较小。

图12 乙醇浓度和提取温度对岩白菜素得率的影响Fig.1 2 Response surface plot showing the effects of ethanol concentration and extraction temperature on yield of bergenin

由图13可知，超声功率与提取时间交互作用的响应曲面比较陡峭，表明两者对岩白菜素得率的影响也比较显著。随着超声功率的提高和提取时间的延长，岩白菜素的得率先缓慢提高，当达到最大值后开始缓慢降低，说明超声功率与提取时间的变化对岩白菜素得率有一定的影响。

图13 超声功率和提取时间对岩白菜素得率的影响Fig.1 3 Response surface plot showing the effects of ultrasonic power and extraction time onyield of bergenin

2.3.3 模拟验证实验 根据Box-Behnken实验得到的结果以及二次多项回归方程，并利用Design expert 8.0.6软件，得本实验回归模型预测的盘龙七岩白菜素提取最佳工艺条件为：超声功率270 W、乙醇浓度77.69%、提取时间40.37 min、提取温度58.63℃。在此条件下盘龙七岩白菜素得率可达6.432%。考虑到实际操作，将最佳工艺修正为超声功率270 W、乙醇浓度75%，每次40 min、提取温度59℃，在此条件下称取盘龙七干燥粉末3份，进行三组验证性实验，岩白菜素的得率分别为6.431%、6.428%和6.429%，平均得率为6.429%（RSD=0.024%），与模型预测值高度相符。

3 结论

各因素对盘龙七岩白菜素得率影响的大小依次为提取温度、超声功率、乙醇浓度和提取时间，即超声提取温度对盘龙七岩白菜素得率的影响最为显著。通过响应面法优化得到盘龙七岩白菜素的超声辅助提取最优工艺条件为提取温度为59℃、超声功率270 W、乙醇浓度75%、提取时间40 min、料液比1∶30、提取3次，在此条件下盘龙七岩白菜素得率为6.429%。本研究结果为盘龙七中岩白菜素的研究及岩白菜素属植物的开发与利用提供了一定的参考。

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Optimization of ultrasonic-assisted extraction of bergenin from Rhizoma Bergeniae Scopulosae by response surface analysis

WANG Xing，ZHAO Hua*，MA Ying-li，YANG Qiu-chen，CHEN Xiao-ling
（College of Biological Science and Engineering，Shaanxi University of Technology，Hanzhong 723000，China）

In order to optimize the conditions of ultrasonic-assisted extraction method of bergenin from Rhizoma Bergeniae Scopulosae，on the base of single-factor experiment，an equation for the ultrasonic wave extraction was built.The experiment showed that ultrasonic extraction power，extraction time，ethanol concentration and extraction temperature had different effects on the extraction yield of bergenin.The result indicated that within tested level ranges，the importance of four process parameters affecting extraction yield of bergenin order were ultrasonic extraction temperature，ultrasonic power，ethanol concentration and ultrasonic extraction time.The optimum extraction conditions of bergenin were obtained as follows:the extraction temperature 59℃，extraction ultrasonic power 270 W，ethanol concentration 75%，extraction time of 40 minutes，the solid-liguid ratio was 1∶30，the extracting times was 3.The yield of bergenin could achieve 6.429%，exhibiting a good agreement with the predicted value.

Rhizoma Bergeniae Scopulosae；bergenin；ultrasonic extraction；response surface methodology

TS201.1

B

1002-0306（2016）02-0307-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.053

2015－06－01

王星（1987-），男，在读硕士研究生，研究方向：植物资源开发利用，E-mail：1771089314@qq.com。

*通讯作者：赵桦（1957-），男，硕士，教授，研究方向：植物资源开发利用，E-mail：zhaohuahz@126.com。

陕西理工学院研究生创新基金项目（SLGYCX1312）；陕西省重点学科专项建设经费资助（2015）。