蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物对糖尿病SD大鼠肾脏的保护作用

董 媛，郭 健，李 艳，王 皓，刘 磊，朱 洁，王会岩（吉林医药学院，吉林吉林132013）

蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物对糖尿病SD大鼠肾脏的保护作用

董 媛，郭 健，李 艳，王 皓，刘 磊，朱 洁，王会岩*
（吉林医药学院，吉林吉林132013）

本文通过链脲佐菌素建立早期糖尿病肾病大鼠模型，考察蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物高剂量组（2 g/kg·d、中剂量组（0.5 g/kg·d）和低剂量组（0.05 g/kg·d）灌胃给药3周后，对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。实验结果表明，与模型组相比，Cs-4高剂量组能够缓解糖尿病大鼠体重的下降（p＜0.05），降低血糖、尿糖和尿微量白蛋白排泄率（p＜0.01）；对肾功能检测指标结果表明，Cs-4能显著降低血清尿素氮（BUN）、尿酸（UA）、肌酐含量（p＜0.01），同时提高血清超氧化物转化酶（SOD）活力（p＜0.01），丙二醛（MDA）含量明显减少（p＜0.01）。肾脏组织切片HE染色结果也表明，Cs-4给药后，肾脏炎症细胞浸润现象明显减少，说明Cs-4提取物能够很好的抗糖尿病和保护肾脏损伤。

蝙蝠蛾拟青霉，Cs-4，链脲佐菌素，糖尿病肾病

蝙蝠蛾拟青霉（Paccilomyces hepiali），是冬虫夏草的无性型，从野生的冬虫夏草子座分离得来［1］，收录于2010版《中国药典》［2］。其主要成分包括多糖、虫草酸、虫草素、维生素等［3］，发挥着免疫调节、软化血管、镇咳等多种功效［4］。现代药理研究还发现蝙蝠蛾拟青霉Cs-4发酵菌粉可调节血脂［5］，对链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ）所致大鼠糖尿病有明显降低血糖的作用［6］。临床上已经用于糖尿病的辅助治疗［7］。但是其对糖尿病患者肾脏的保护作用还不是很明确。糖尿病肾病（DiabetesNephropathy，DN）是糖尿病常见的慢性微血管并发症，其病因是肾组织中过多的葡萄糖积累，已成为糖尿病死亡的主要原因之一［7］。早期DN是治疗的关键时期，此时患者表现为肾功能不全，但尚未达到透析治疗的程度，目前仍然缺乏有效的治疗手段和药物［8］。本研究采用STZ诱导SD大鼠糖尿病早期肾病模型，考察蝙蝠蛾拟青霉菌粉Cs-4对糖尿病大鼠肾脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉 购买于江苏神华药业有限公司；实验动物 SD（Sprague Dawley）大鼠，清洁级，体重180～220 g，雄性，合格证号为SCXK-（吉）2013-0003，由长春生物制品研究所提供；链脲佐菌素（STZ）等 Sigma；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、血清尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）、葡萄糖、肌酐、尿微量白蛋白测定试剂盒 购自南京建成生物科技有限公司。

DHP-908型电热恒温培养箱 上海一恒仪器有限公司；ELX800型酶标仪 美国BIOTEK公司。

1.2 实验方法

1.2.1 蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物制备 依据文献［9］制备Cs-4提取物。准确称取100 g蝙蝠蛾拟青霉Cs-4菌粉热水浸提，在温度80℃，料液比1∶50条件下，提取2次，每次提取时间3 h，1500 r/min离心，合并上清，减压浓缩后，所得浸膏即为水提粗提物（WE），置4℃冰箱保存备用，给药前用适当生理盐水稀释至所需浓度，灌胃给药。

1.2.2 蝙蝠蛾拟青霉成分分析 依照文献［10］方法定性分析WE中化学成分的种类，对可能的活性物质进行初步鉴定。鉴定项目包括：氨基酸、多肽、蛋白质、还原糖、糖类、鞣酸、酚类、生物碱类、甾醇类、环烯醚萜类、有机酸、油、挥发油、蒽醌类、黄酮类、香豆素和内酯类化合物。

1.2.3 STZ诱导的糖尿病肾病大鼠模型的建立及分组 健康SD大鼠，禁食不禁水12 h，连续3次腹腔注射2%STZ，注射剂量为30 mg/kg·d。注射后3 h灌胃含25%葡萄糖0.8 mL/200 g；末次注射后尾静脉采血，测空腹血糖，以血糖值≥11.1 mmol/L者作为糖尿病模型大鼠，喂养4周后，尿糖定性为（+++），尿微量白蛋白排泄率＞30 mg/24 h者为早期糖尿病肾病模型造模成功［11］。正常对照组注射等体积柠檬酸缓冲液（pH4.3）。将造模成功的大鼠按体重及血糖分为模型对照组、盐酸二甲双胍阳性对照组（Met，120 mg/kg·d）、提取物高剂量组（2 g/kg·d）、中剂量组（0.5 g/kg·d）和低剂量组（0.05 g/kg·d），每组10只。

1.2.4 蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物对大鼠糖尿病肾病的治疗作用研究 连续灌胃给药21 d，正常对照组和模型对照组给予等量生理盐水，分别于给药第0、10、21 d，称重，收集24 h尿液，依照文献［11］测定尿糖和微量白蛋白排泄率，并尾静脉取血，测定血清中空腹血糖浓度。末次给药后，尾静脉取血，测定血清SOD活力、MDA含量、BUN、UA、肌酐含量，测定方法见说明书。脱臼处死大鼠后，收集肾脏，4%多聚甲醛固定，制备石蜡切片，HE染色观察进行病理分析［12］。

1.2.5 统计学分析 所有实验数据均采用平均值±标准偏差SD表示。运用软件Origin 8.5统计分析实验数据。应用t检验法分析各组实验数据之间是否存在显著差异，p≤0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 WE成分鉴定

热水浸提法提取的是Cs-4菌丝体中的水溶性物质，通过化学显色反应，可以初步判定Cs-4水提物中成分的种类。结果如表1所示，Cs-4水提物中含有蛋白质、多糖和有机酸类。这与2010版《中国药典》中冬虫夏草的主要成分一致。

表1 粗提物化学成分初步分析结果Table1 Summary of preliminary chemical analysis of crude extracts

2.2 蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物对大鼠糖尿病肾脏的保护作用

表2 给药期间各组糖尿病大鼠的体重和空腹血糖结果（平均值±SD，n=10）Table2 Bodyweight and fasting blood glucose of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.1 蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物对糖尿病大鼠体重等指标的影响 糖尿病病症有“三多一少”现象，为了考察Cs-4提取物的抗糖尿病肾病作用，采用STZ诱导大鼠糖尿病肾病模型，监测糖尿病大鼠给药3周期间的体重、尿糖、尿微量白蛋白排泄率和空腹血糖，结果如表2～表3所示。模型组建模后4项指标均与正常组存在显著差异（p＜0.01），说明造模成功。经过3周给药后，Cs-4高剂量组能够缓解糖尿病导致的大鼠体重减轻（p＜0.05），血糖下降54.8%，尿糖和微量白蛋白排泄率也明显降低（p＜0.01），和阳性对照组效果相当；中剂量组与模型组相比，血糖、尿糖和微量白蛋白排泄率减少（p＜0.05），低剂量组和模型组相比没有统计学上的差异（p＞0.05）。

表3 给药期间各组糖尿病大鼠的尿糖和24 h微量白蛋白排泄率结果（平均值±SD，n=10）Table3 Urine sugar and urinary albumin excretion rate in 24 h of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.2 蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物对糖尿病大鼠肾功能的影响 经Cs-4提取物治疗3周后，各组糖尿病大鼠血清中的BUN、UA和肌酐含量结果如表4所示。模型组肾功能损伤明显，与正常组相比，BUN、UA、肌酐含量存在显著差异（p＜0.01）。通过Cs-4提取物给药后，各项肾功能指标均有所降低，其中高剂量组治疗效果最佳，与阳性对照药接近，与模型组存在显著差异（p＜0.01）。中剂量组与模型组相比，BUN降低（p＜0.01），UA和肌酐含量也有所降低（p＜0.05）。低剂量组和模型组相比没有统计学上的差异（p＞0.05）。

表4 给药期间各组糖尿病大鼠肾功能检测指标结果（平均值±SD，n=10）Table4 Renal function tests of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.3 蝙蝠蛾拟青霉Cs-4提取物对糖尿病大鼠抗氧化能力的影响 SOD能清除体内自由基，而MDA则是膜脂过氧化最重要的产物之一，二者能够反映出机体清除自由基的能力。糖尿病患者长期处于高血糖状态，会增加体内自由基的产生，本实验考察了糖尿病大鼠SOD和MDA两项指标，结果如表5所示。经Cs-4提取物给药后，高剂量组大鼠血清SOD水平明显提高，MDA含量也明显降低，与模型组相比存在显著差异（p＜0.01）；中剂量组与模型组相比，MDA含量也有所降低（p＜0.05），SOD水平有所提高（p＜0.05）。低剂量组和模型组相比没有统计学上的差异（p＞ 0.05）。说明中剂量和高剂量的Cs-4提取物能够增强大鼠抗氧化能力。

表5 给药期间各组糖尿病大鼠抗氧化水平检测结果（平均值±SD，n=10）Table5 Antioxidant levels of diabetic rats（mean±SD，n=10）

2.2.4 肾脏组织切片分析 各组大鼠肾脏组织切片如图1所示。正常对照组（图1A）大鼠的肾脏肾小球在切片上呈圆形，无明显增大或缩小，系膜无增生，肾小管无萎缩。模型组糖尿病大鼠有典型的早期糖尿病肾病症状，肾小球、肾小管萎缩，大量炎症细胞浸润，肾系膜增生（图1B）。经过Cs-4治疗3周后，从切片结果看，炎症细胞浸润明显好转，说明Cs-4对糖尿病肾病有一定的缓解作用。

图1 糖尿病大鼠肾组织切片HE染色分析（×200）Fig.1 Histopathological analysis in l kidney collected from all experimental rats through HE staining（×200）

3 结论

冬虫夏草作为传统的中药，在我国使用已有悠久的历史。本文研究了冬虫夏草无性型蝙蝠蛾拟青霉对糖尿病大鼠肾脏的保护作用，结果显示，与模型组相比，Cs-4提取物，尤其是高剂量组可明显降低糖尿病大鼠的空腹血糖、尿糖的含量，增加大鼠体重，具有统计学差异。此外，还能够明显降低糖尿病大鼠尿微量白蛋白排泄率，降低大鼠血清中BUN、UA和肌酐含量，具有统计学差异，表明其能改善糖尿病大鼠肾功能。抗氧化水平结果显示，Cs-4可提高血清SOD水平，降低MDA水平，表明其能提高大鼠抵抗自由基的能力。切片结果显示，与糖尿病模型组相比，Cs-4高剂量组能缓解炎症细胞的浸润，显示蝙蝠蛾拟青霉对糖尿病大鼠肾脏有良好的保护作用。但本研究也存在许多局限，如没有对蝙蝠蛾拟青霉保护肾脏的机制做进一步研究，但仍为其临床研究提供了基础，具有巨大的开发空间。

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Study on the anti-diabetic nephropathy activities of Paccilomyces hepiali extract on diabetic sprague-dawley rats

DONG Yuan，GUO Jian，LI Yan，WANG Hao，LIU Lei，ZHU Jie，WANG Hui-yan*
（Jilin Medical University，Jilin 132013，China）

This work investigated the anti-diabetic nephropathy activities of Paccilomyces hepialid extract，Cs-4，on STZ-induced diabetic sprague-dawley rats.Sprague-dawley rats were orally administered with water extract at 0.05 g/kg，0.5 g/kg and 2 g/kg for 3 weeks，respectively.Then，related biochemical indexes were determined.Data showed that similar as metformin，the high dose group of Paccilomyces hepiali extract could improve the body weight loss caused by diabetes（p＜0.05），and displayed a significant reduction in fasting blood glucose，urine glucose and urinary albumin excretion rate（p＜0.01）.Meanwhile，renal function tests showed that Paccilomyces hepiali extract displayed a significant reduction in BUN，UA and creatinine（p＜0.01）.The serum SOD activity was enhanced（p＜0.01）and the MDA level was decreased（p＜0.01）.Pathological morphology reversion in histopathological sections showed that inflammatory cell infiltration was significantly reduced after treatment which confirmed that Cs-4 presents excellent anti-diabetic and anti-nephropathic activities.

Paccilomyces hepiali；Cs-4；STZ；diabetic nephropathy

TS201.1

A

1002-0306（2016）02-0358-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.064

2015－05－29

董媛（1986-），女，博士，讲师，研究方向：食药用真菌研究，E-mail：dongyuan19860910@126.com。

*通讯作者：王会岩（1968-），女，博士，副教授，研究方向：生物技术制药，E-mail：zswhy518@163.com。

吉林市科技发展计划资助项目（20156430）。