虾青素及维生素E联用对急性酒精引起的氧化应激大鼠的影响

白云（呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古呼伦贝尔021000）

虾青素及维生素E联用对急性酒精引起的氧化应激大鼠的影响

白云
（呼伦贝尔职业技术学院，内蒙古呼伦贝尔021000）

研究虾青素与维生素E联合作用对酒精诱导氧化应激大鼠血清及组织的影响。将50只雄性Wistar大鼠随机分为5组：对照组（n=10）、模型组（n=10）、虾青素组（n=10，0.6 g·kg-1·d-1）、维生素E组（n=10，0.2 g·kg-1·d-1）、虾青素（0.3 g·kg-1·d-1）及维生素E（0.1 g·kg-1·d-1）联用组（n=10）。连续30 d给予抗氧化剂，末次灌胃12 h后，除对照组外，其余各组灌胃12 mL/kg 50%酒精溶液诱导氧化应激。观察各抗氧化剂组对大鼠的影响。研究表明单独服用虾青素（AX）及维生素E（VE）均可提高血清及心、肝、肾组织的总抗氧化能力（T-AOC）及谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性，并且降低血清及心、肝、肾组织的丙二醛（MDA）含量。虾青素组及维生素E组抗氧化效果均未有虾青素及微生素E联用组效果明显。结果表明虾青素与维生素E联用可能具有协同作用，与单一抗氧化剂相比，虾青素与维生素E联用具有更强的抗氧化性，并对急性酒精引起的氧化应激具有明显的保护效果。

虾青素，维生素E，急性酒精，氧化应激，大鼠

虾青素（Astaxanthin）呈红色，是一种天然类胡萝卜素，化学名称为3，3′-二羟基-β，β-胡萝卜素-4，4′-二酮。可从大多数蟹类、虾类、鱼类中分离得到［1］。近年来研究表明，虾青素具有极强的抗氧化性，并被作为高级保健品进行开发。此外，很多研究者通过临床实验和动物实验证明虾青素可抑制肿瘤生长、增强免疫力、预防心血管疾病、抗氧化保肝等功能［2］。也有体外实验证实它是单线态氧的淬灭剂，具有极强的清除自由基能力，是一种强抗氧化剂［3］。维生素E是一种脂溶性维生素，又称为生育酚，它是生物体内的一种天然抗氧化剂。它对氧敏感，容易被氧化，故可以保护易被氧化的物质，降低氧化损伤。在生物系统中发挥着降低氧化应激、脂质过氧化的作用［4］。

有研究表明，虾青素与维生素E的抗氧化性可降低磺粘菌素导致的肾氧化损伤［5］。氧化应激指生物系统遭受刺激时，体内活性氧自由基与活性氮自由基过度生成，氧化物的生成超过了氧化物的清除，氧化系统与非氧化系统失去平衡，导致组织损伤的过程。酒精提供了氧化应激产生的良好环境，酒精诱导的氧化应激直接参与生成活性氧（ROS），从而形成良好的氧化应激的环境，ROS参与各种生理及病理过程［6］。一定剂量的酒精破坏促氧化剂与抗氧化剂之间的平衡，导致生物分子的氧化损伤。维生素E、虾青素这类抗氧化剂可以改善氧化损伤。体外研究已表明维生素E与虾青素联用可更有效抑制自由基产生，同时阻断脂质过氧化物的合成［7］。目前，对虾青素与维生素E单独服用抑制氧化应激的研究很多，但是虾青素及虾青素维E联用对酒精引起的氧化应激作用国内未见报道。

本实验通过建立急性酒精氧化应激大鼠模型，并连续给予抗氧化药剂，实验结束后，测定各实验组大鼠血清及各组织器官的组织匀浆中各抗氧化指标，对各抗氧化剂抗氧化能力进行评价，目的在于探讨维生素E与虾青素联用对急性酒精引起的氧化应激的损伤的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

维生素E 购于西格玛奥德里奇德国斯德海姆分公司；虾青素（AstaREAL®） 购于富士化学产业株式会社美国分公司；无水酒精 为内蒙古赤峰瀚森化工有限公司产品，分析纯试剂；总抗氧化力（TAOC）检测试剂盒、超氧化物歧化酶（SOD）检测试剂盒、丙二醛（MDA）检测试剂盒、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）检测试剂盒、谷胱甘肽（GSH）检测试剂盒、蛋白质羰基（CP）检测试剂盒 均购自南京建成生物工程研究所；Wistar大鼠 50只，雌性，体质量（180±20）g，由斯贝福（北京）实验动物科技有限公司提供，许可证编号：SCXK（京）2011-0004。

MK3型酶标仪 美国Thermo公司；IKA MS3型迷你振荡器 广东广州仪科实验室技术有限公司；ZY-1003S型数控超声波清洗器 上海早赢精密清洗有限公司；HA-FJ200型高速分散均质机 北京润恒奥仪器仪表设备有限公司；GTR16-2型高速冷冻离心机 北京时代北利离心机有限公司；艾本德移液枪 德国艾本德公司；96孔板 北京北方同正生物技术发展有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 实验动物分组及给药方法 实验动物在控制室［温度：（24±2）℃，光照：12 h光照/黑暗循环，相对湿度50%±5%］中单笼饲养，大鼠自由进食、饮水［8］。7 d适应期结束后随机分为5组：正常组、模型组、虾青素组、维生素E组、虾青素和维生素E联用组。正常组（C）与模型组（M）每天灌胃1 mL生理盐水，虾青素组（AX）剂量0.6 g/（kg·d）灌胃（以植物油为溶媒，用高速分散均质机混匀），维生素E组（VE）剂量0.2 g/（kg·d）灌胃（以植物油为溶媒，用高速分散均质机混匀），虾青素维生素E连用组（AXVE）灌胃剂量：0.3 g/（kg·d）虾青素与0.1 g/（kg·d）的维生素E混合（以植物油为溶剂高速分散均质机混匀）［8］。

1.2.2 模型建立 实验动物灌胃30 d，末次给药12 h后，除正常组外，其余各组灌胃12 mL/kg 50%酒精溶液，6 h后，颈椎脱臼法处死动物，抽取血样及分离组织。

1.2.3 指标测定 血液生化指标测定：实验结束时大鼠股动脉取血，将分离出的血清（4℃，3000 r/min，10 min）保存于-80℃备用。按试剂盒说明书方法测定T-AOC、SOD、MDA、GSH-PX、GSH、CP。

组织生化指标测定：取肝、心、肾组织在冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，用灭菌生理盐水做匀浆介质4℃下制得10%肝、心、肾匀浆（w∶v），将浆液3000 g于4℃离心15 min，取上清液分装，-80℃保存备用。按试剂盒说明书方法测定TAOC、SOD、MDA、GSH-PX、GSH、CP。肝、心、肾组织匀浆蛋白质含量按照Lowry法测定［9］。

1.2.4 数据处理与统计分析 采用SPSS 17.0软件（SPSS Inc.）进行统计，并以（平均值±标准差）表示，多个样本均数的比较采用ANOVA检验，两两比较采用LSD检验。

2 结果与讨论

2.1 抗氧化剂对急性酒精引起氧化应激大鼠血清及组织器官T-AOC活性的影响

由图1可知，与对照组相比，模型组的血清及各组织器官T-AOC活性均极显著降低（p＜0.01），说明酒精导致的氧化应激损伤模型成功建立。T-AOC活性全面反映体内抗氧化防御系统。AX、VE组与模型组相比，血清、肝、心组织T-AOC活性均无显著性差异。然而，与模型组相比，单独服用AX或VE可显著升高肾组织T-AOC活性（p＜0.05）。说明AX与VE对酒精引起的氧化应激损伤有保护作用但不明显。AXVE组与模型组相比，可显著升高血清T-AOC活性（p＜0.05），显著升高肝、心组织T-AOC活性（p＜0.05），极显著升高肾组织T-AOC活性（p＜0.01）。AXVE组与对照组相比，血清T-AOC活性显著降低（p＜0.05）。由结果可知，与单一AX或VE相比，AXVE组对酒精引起的氧化损伤具有更有效的潜在治疗作用。

图1 抗氧化剂对大鼠T-AOC活性的影响Fig.1 Effect of antioxidants on the T-AOC activity in rats

2.2 抗氧化剂对急性酒精引起氧化应激大鼠血清及组织器官SOD活性的影响

由图2可知，与对照组相比，模型组的血清及各组织匀浆SOD活性均极显著降低（p＜0.01），说明酒精导致的氧化应激损伤模型成功建立。SOD是生物体内重要的抗氧化酶类，它的含量高低反映体内氧化应激水平。AX、VE组与模型组相比，可显著升高血清及肝、心组织SOD活性（p＜0.05）。AX、VE组与模型组相比，肾组织SOD活性无显著性差异。说明AX与VE对升高酒精引起的氧化应激损伤大鼠SOD水平有一定作用。AXVE组与模型组相比，可极显著升高血清及肝、心、肾组织SOD活性（p＜0.01）。结果表明，与单一AX或VE相比，AXVE联用可明显恢复或缓解急性酒精导致SOD活性剧变，有利于保持氧化与抗氧化系统的平衡。

图2 抗氧化剂对大鼠SOD的影响Fig.2 Effect of antioxidants on the SOD activity in rats

2.3 抗氧化剂对急性酒精引起氧化应激大鼠血清及组织器官MDA含量的影响

由图3可知，与对照组相比，模型组血清及组织MDA含量均极显著升高（p＜0.01），说明酒精导致的氧化应激损伤模型成功建立。MDA反映生物体内内源性脂质过氧化物及过氧化物水平。AX组与模型组相比，显著降低血清与肝、心组织MDA含量（p＜0.05）。VE组与模型组相比，血清MDA含量显著降低（p＜0.05），心组织MDA含量显著降低（p＜0.05），肝、肾组织MDA含量无显著性差异。说明AX与VE对降低酒精引起的氧化应激损伤大鼠MDA水平作用不明显。AXVE与模型组相比，可极显著降低血清与肝、心、肾组织MDA含量（p＜0.01）。结果显示，相比单独使用AX或VE，AXVE联用更能有效调节由急性酒精导致体内组织急剧升高的MDA含量变化。

图3 抗氧化剂对大鼠MDA含量的影响Fig.3 Effect of antioxidants on the MDA content in rats

2.4 抗氧化剂对急性酒精引起氧化应激大鼠血清及组织器官GSH-Px活性的影响

由图4可知，与对照组相比，模型组的血清及组织GSH-Px活性均极显著降低（p＜0.01），说明酒精导致的氧化应激损伤模型在本研究中已成功建立。AX组与模型组相比，血清与心组织GSH-Px活性显著升高（p＜0.05），肾组织GSH-Px活性极显著升高（p＜0.01）。说明AX可提高酒精引起的氧化应激损伤大鼠GSHPx活性。VE组与模型组相比，血清与肝、心、肾组织GSH-Px活性均无显著性差异。说明VE不能提高酒精引起的氧化应激损伤大鼠GSH-Px活性。AXVE与模型组相比，血清与肝、肾组织GSH-Px活性极显著升高（p＜0.01），心组织GSH-Px活性显著性升高（p＜0.05）。说明AXVE联用可提高酒精大鼠组织内GSHPx活性。

图4 抗氧化剂对大鼠GSH-Px活性的影响Fig.4 Effect of antioxidants on the GHS-Px activity in rats

2.5 抗氧化剂对急性酒精引起氧化应激大鼠血清及组织器官GSH活性的影响

由图5可知，与对照组相比，模型组的血清及组织GSH活性均极显著降低（p＜0.01），说明酒精导致的氧化应激损伤模型成功建立。AX组与模型组相比，心组织GSH活性显著升高（p＜0.05）。说明AX对酒精引起的氧化应激损伤大鼠GSH活性无影响。VE组与模型组相比，血清与肝、心、肾组织GSH活性无显著性差异。说明VE对酒精引起的氧化应激损伤大鼠GSH活性无影响。AXVE与模型组相比，血清与心、肾组织GSH活性极显著升高（p＜0.01），肝组织GSH活性显著性升高（p＜0.05）。结果表明，较单一AX或VE，联用可更有效恢复急性酒精引起的GSH活性变化。

图5 抗氧化剂对大鼠GSH活性的影响Fig.5 Effect of antioxidants on the GHS activity in rats

2.6 抗氧化剂对急性酒精引起氧化应激大鼠血清及组织器官CP含量的影响

由图6可知，与对照组相比，模型组的血清及组织CP含量均极显著升高（p＜0.01），说明酒精导致的氧化应激损伤模型成功建立。AX、VE组与模型组相比，血清与肝、心、肾组织CP含量无显著性差异。说明AX与VE并不能降低酒精引起的氧化应激损伤大鼠CP含量。AXVE与模型组相比，可极显著降低血清CP含量（p＜0.01），显著性降低肝、心、肾CP含量（p＜0.05）说明AXVE联用可降低酒精导致的CP含量升高，其调节作用在血清和心组织内尤为突出。

图6 抗氧化剂对大鼠CP含量的影响Fig.6 Effect of antioxidants on the CP content in rats

3 讨论

虾青素作为一种广泛存在于生物及植物体内的物质，其抗氧化作用很可能保护乙醇氧化应激造成的损伤。酒精中毒会导致人或动物代谢紊乱，氧化应激是酒精诱导细胞损伤的发病重要机制之一［10］。目前研究发现急性酒精对人体损伤很可能是由于体内ROS增多，脂质过氧化及抗氧化酶活性被抑制导致［11］。酒精抑制了生物系统的抗氧化活动，导致自由基积累。MDA与CP是内源性脂质过氧化物及过氧化物的标志，大多数的组织损伤被认为是自由基攻击生物膜导致的［12］。T-AOC反映了动物机体的抗氧化防御系统，SOD是生物体内重要的抗氧化酶，它体现生物体氧化应激的状态，反应了生物体内清除自由基的水平和能力［13］。GSH与GSH-Px是生物体内另一种抗氧化剂及自由基清除剂，它可以保护细胞膜结构与功能不受过氧化物损害［14］。有研究证明VE可以降低氧化应激的水平，并可预防心血管疾病等慢性病。虾青素和VE联用有很好的效果，其协同作用可有效缓解高脂饮食导致氧化损伤［4］。

本实验对比虾青素组、VE组、虾青素与VE联用组对急性酒精引起的氧化应激大鼠的影响。为了更好了解各抗氧化剂组对急性酒精引起的氧化损伤的保护作用，对大鼠血清及肝、心、肾组织的MDA水平、蛋白质羟基、GSH及抗氧化酶的活性（T-AOC、SOD、GSH-Px）进行测定。结果发现，急性酒精引起的氧化应激大鼠的T-AOC及GSH、SOD、GSH-Px明显降低，MDA及CP含量明显升高，并且单独服用虾青素及VE均可提高血清及心、肝、肾组织的T-AOC及GSH、SOD、GSH-Px活性，降低血清及心、肝、肾组织的MDA。此发现可用不同的机制解释，假设最可能的机制是由于虾青素的化学结构使它成为很强的抗氧化剂。虾青素分子是由2羰基和2个羟基基团，和11个共轭烯属双键组成，形成了共轭多烯系统。有研究结果表明，虾青素清除ROS机制极大可能是拮抗酒精作用［15］。急性酒精引起生理应激状态，从而导致细胞水平上一系列不良的影响。氧化应激是ROS生成和抗氧化系统平衡的紊乱，过量ROS生成会导致细胞内大分子（包括脂质、蛋白质、核酸）的损坏。ROS的生成和释放能够被多种抗氧化系统（包括酶与非酶抗氧化系统）分解。在线粒体基质内，SOD被看做是第一条抗氧化系统防线，它可以转化超阴离子为过氧化氢，进而被第二道抗氧化防线GSH-Px代谢。MDA反映了脂质过氧化物含量。在病理状态下，过量ROS的产生会损害细胞结构，抑制正常的生理功能，因此，在氧化应激下，增强抗氧化防御系统活力是一种保护机制。进一步研究表明，VE与虾青素有联合作用，可以避免生物膜氧化损伤［4］。这种联合作用表现在虾青素与VE联用组比单一给药组对血清及组织抗氧化活性指标的改善更为显著。口服虾青素与VE抗氧化剂能够有效激活体内酶与非酶系统，从而抑制或延迟了细胞和组织的氧化。实验结果表明，通过对比血清及心、肝、肾组织中的T-AOC及GSH、SOD、GSH-Px活性，血清及心、肝、肾组织中的MDA与CP含量，虾青素与VE联用组较单一抗氧化剂组显著缓解急性酒精引起的氧化应激大鼠的损伤。本实验结果与以往研究发现相符。

4 结论

本研究结果表明，急性酒精异常提高氧化应激，降低胞外抗氧化物酶活力。通过虾青素与VE联用可以增强抗氧活力，最终减缓或提高自由基降解水平，减少ROS和脂质过氧化物。此外结果还表明T-AOC、SOD和GSH-Px活力有效恢复，进一步阐明虾青素与VE联用是通过降低ROS和脂质过氧化物来调节氧化与抗氧化的平衡，最终缓解酒精引起的氧化应激损伤。另外，Ghlissi Z等报道，虾青素与VE联用较单一抗氧化剂恢复组更有效缓解高脂饮食导致氧化损伤，并进一步改善认知功能障碍［4］。由此推论，虾青素与VE联用很可能具有协同作用，与单一抗氧化剂相比具有更强的抗氧化性，并对急性酒精引起的氧化应激具有明显的保护效果。本实验为相关功能食品或药品的开发提供了重要理论依据。然而，虾青素与VE联用的量效关系与作用机理还有待进一步研究。

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Effect of astaxanthin combined with vitamin E on acute alcohol-induced oxidative stress in rats

BAI Yun
（Hulunbeier Vocational Technical College，Hulunbeier 021000，China）

The present study was conducted to investigate the combination effects of astaxanthin（AX）combined with vitamin E on reversing acute alcohol-induced oxidative stress in rats.Total 50 male Wistar rats were selected and randomly divided into control group（n=10），model group（n=10），AX group（n=10，0.6 g·kg-1·d-1），VEgroup （n=10，0.2 g·kg-1·d-1）and AXVE（0.3，0.1 g·kg-1·d-1）group（n=10）.Following a 30 consecutive with antioxidative drugs treatment，model group，AX group，VEgroup and AXVE group（n=10）oral received a single dose of alcohol（12 mL·kg-1）12 hours after the last treatment.Anti-oxidative indices of serum and organs samples were collected and detected 6 hour after alcohol treatment.In comparison with model group，AX，VEand the combination reagents of AX and VEenhanced the activities of the total anti-oxidative capacity（TAOC），glutathione（GSH），superoxide dismutase（SOD），glutathione peroxidase（GSH-Px）from serum，heart，liver and kidney samples，while inhibited the malondialdehyde（MDA）levels in the serum，heart，liver and kidney，with a predominant effects of complex treatment.The findings indicated that compared to treatment of AX or VEalone，AX combined with VEtogether mitigated oxidative damage effectively which induced by acute alcohol exposure.It might due to the synergistic actions of AX combined with VE.

astaxanthin；vitamin E；acute alcohol exposure；oxidative stress；rats

TS254.9

A

1002-0306（2016）02-0362-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.02.065

2015－06－12

白云（1972-），女，硕士，高级讲师，研究方向：食品加工与安全，E-mail：274923871@qq.com。