戊二醛改性明胶耐酶解条件的优化

张单单，白 鸽，王 琳，冯丽萍，魏 冰，曹雁平，，*（.北京工商大学食品学院，北京00048；.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心，北京00048）

戊二醛改性明胶耐酶解条件的优化

张单单1，白 鸽1，王 琳1，冯丽萍1，魏 冰2，曹雁平1，2，*
（1.北京工商大学食品学院，北京100048；2.食品添加剂与配料北京市高校工程研究中心，北京100048）

采用明胶为原料，以戊二醛为改性剂，以水解度为指标，通过单因素实验和均匀实验设计，研究戊二醛浓度、改性pH、温度和时间及各因素交互作用对水解度的影响，利用偏最小二乘回归法建立二次多项式回归方程，并确定戊二醛改性明胶耐酶解最佳处理条件为：戊二醛浓度0.9%、pH=6.0、改性温度57℃，改性时间16 min。在该条件下，改性明胶在60 min的水解度为4.35%。在此条件下实际水解度为4.68%，相对误差约为7.05%。说明建立的预测模型具有一定的实践指导意义。与未改性明胶相比较，耐酶解能力提高了18.75%。

明胶，改性，戊二醛，水解度

明胶是由胶原部分水解而得到的一类蛋白质，因此明胶具有良好的生物相容性［1］，并具有优良的物理性质如胶冻力、分散稳定性、持水性、成膜性等［2］，明胶形成凝胶后，可以作为风味剂、糖及其他配合物的载体，在食品工业中有广泛的应用［3］。但明胶易被蛋白酶酶解、机械强度小、易受细菌污染而变质等，通常通过改性来增强明胶的机械强度，调节其降解速率，扩大其应用领域［4］。

戊二醛是常用的明胶改性试剂之一［5］，具有反应活性高、反应快、结合量高、产品稳定等优点［6］。有关戊二醛改性明胶通常是增强明胶机械性能、疏水性能等。例如Bigi等［7］使用1%戊二醛交联A型明胶，通过X射线衍射仪（XRD）、差示扫描量热仪（DSC）、溶胀率等手段表征结果表明，戊二醛降低了明胶的吸水性而增大其机械强度。Bigi等［8］通过DSC研究表明，戊二醛交联使明胶膜的热稳定性增加，正如变性温度向更高的值转移一样。在抗酶解方面，仅研究了戊二醛改性胶原抗酶解性能，例如单志华等［9］研究当戊二醛用量大于1%，胶原酶水解前后的物性基本不变，证明皮胶原耐酶解能力显著提高。Thomposn等［10］报道戊二醛交联胶原膜与未交联胶原膜比较，高应变模量、抗胶原酶降解能力显著提高，而膨胀率显著降低。但戊二醛改性明胶抗酶解方面的研究一直未见报道。

本文以戊二醛改性明胶，采用茚三酮比色法，测定改性明胶水解度，通过单因素和均匀设计实验，采用偏最小二乘法回归法处理数据，建立二次多项式回归方程的预测模型，并确定戊二醛改性明胶最佳优化处理条件，从而提高明胶耐酶解能力，提高材料的稳定性，为工业生产中固定化酶的载体研究提供一种新思路，同时为明胶材料控制释放理论研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

明胶、25%戊二醛溶液、甘氨酸、十二水合磷酸氢二钠、二水合磷酸二氢钠、茚三酮、醋酸丁酯 均来自上海国药集团化学试剂有限公司；木瓜蛋白酶（测定活力4.96×105U/g） 美国Sigma公司；无水乙醇 分析纯，北京化工厂。

CP214电子分析天平 上海市奥豪斯仪器有限公司；DC-2006型低温恒温水浴锅 浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；UVmini-1240型紫外-可见分光光度计 日本岛津公司；DF-101S型集热式恒温加热磁力搅拌器 河南省巩义市予华有限责任公司；FE20型pH计 梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；CT3质构分析仪、LVDV-Ⅱ+Pro型旋转数显粘度计 来自美国Brookfield公司；Kjeltec 8400半自动凯氏定氮仪 德国福斯公司。

1.2 实验内容与方法

1.2.1 明胶浓度的确定 称取一定质量明胶制成质量浓度分别为5%、10%、15%、20%、25%、30%的明胶溶液，取一部分用于测定不同浓度下明胶的粘度，另一部分成型后于4℃冰箱中保存，测定其凝胶强度。

1.2.2 不同条件下戊二醛改性明胶球的制备 在

1.2.1 的结果下，取一定质量明胶溶于磷酸盐缓冲溶液中，60℃恒温水浴锅完全溶解，在一定温度下缓慢滴加不同浓度的戊二醛溶液1 mL，反应后冷却到室温，滴加到200 mL不断搅拌的冷的醋酸丁酯中，通过调节转速控制球珠的大小（4±1）mm。形成球珠后捞出浸泡在100 mL 0.5%戊二醛溶液中，4℃冰箱储藏30 min后，水洗三遍，滤干，放置在冰箱中备用［11］。同时以未改性明胶球作对比。

1.2.3 改性明胶水解度单因素实验 以水解度为实验指标，固定戊二醛浓度0.7%、戊二醛反应pH=6.0、温度50℃、时间30 min，通过单因素实验，研究戊二醛浓度（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）、改性pH（6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）、温度（40、45、50、55、60℃）及时间（15、30、45、60、75 min）对改性明胶水解度的影响。

1.2.4 改性明胶水解度均匀实验 根据上述单因素实验，选择戊二醛浓度、改性pH、温度和时间进行4因素5水平的均匀实验，分析各因素以及交互作用对水解度的影响，利用偏最小二乘法回归法处理数据，模拟得到二次多项式回归方程的预测模型，并确定戊二醛改性明胶最佳优化处理条件，均匀实验因素水平表见表1。

表1 实验因素水平表Table1 Factors and levels for the trial

1.3 检测评价方法

1.3.1 水解度（DH）的测定 在三角瓶中加入20倍明胶球重的磷酸盐缓冲溶液中（pH=7.0），放入4%明胶球重的木瓜蛋白酶，最后加入明胶球，摇匀置于恒温振荡器中，保持40℃水浴温度，每隔30 min取水解液，沸水浴灭酶5 min，共取5个点。采用茚三酮法［12］测定水解液中氨基氮含量，采用凯氏定氮法［13］测定总氮含量。水解度［14］DH（%）计算公式：

式（1）中，Ah—不同时间水解液中的氨基氮含量（μg）；A0—明胶中固有的氨基氮含量（μg）；Az—明胶总氮含量（μg）。

1.3.2 凝胶强度测定 凝胶强度测定采用Bloom法［15-16］，采用CT-3质构仪测定。测定条件为：柱塞P0.5；下压4 mm，压力5 g，压入后速度1 mm/s。测定步骤：将样品在质构仪圆台上放平，柱塞对准胶面中心后下压，记录最大力。每一个待测样品作三个平行样，重复测定2次，取平均值。

1.3.3 粘度测定 采用博勒飞LVDV-Ⅱ+Pro型旋转数显粘度计测定［17］。配制不同浓度的明胶溶液置于恒温水浴锅中，温度保持在（65±1）℃的中，每一个待测样品作三个平行，取平均值。

1.4 数据处理

实验各值均为3个平行数据的均值，结果表示为“平均值±标准差”。采用DPSv15.10（杭州睿丰信息技术有限公司）数据处理系统进行均匀实验因素设计。数据统计结果与分析采用Microsoft Excel 2007和Origin 9.0软件（美国OriginLab公司）分析。用SPSS 17.0软件（美国IBM公司）进行方差分析（p＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 明胶浓度的确定

表2所示，不同浓度明胶溶液的粘度和凝胶硬度具有显著性差异（p＜0.05）。明胶溶液粘度越大，戊二醛溶液的渗透能力越弱，不利于醛基与明胶氨基结合，并且凝胶硬度与弹力对包埋介质是否表现出良好的控释能力起关键作用。浓度为20%明胶凝胶硬度显著提高到1032.07 g，弹力指数0.92，粘度增加到45.50 mPa·s，继续增加明胶浓度导致溶液过于黏稠，不利于戊二醛溶液的渗透，同时20%明胶成球性较好，综上因素分析采用浓度为20%的明胶做后续研究。

表2 不同浓度明胶的粘度、硬度与弹性Table2 Viscosity，hardness and elasticity of different concentrations of gelatin

2.2 单因素实验结果

2.2.1 戊二醛浓度对水解度的影响 由图1可知，水解度随着戊二醛浓度的增加而降低，其中戊二醛浓度0.7%时显著降低（p＜0.05），水解度达到最低。与未改性明胶相比较，耐酶解能力提高了18.75%。金勋杰［18-19］对不同浓度戊二醛改性明胶的交联度、溶胀率与降解率方面做了研究，结果表明1%戊二醛浓度时，交联度已达到很高的程度，浓度超过1%时，各指标变化幅度较小。这与本实验结果相吻合。这是由于戊二醛浓度的增大，醛基与氨基结合形成的希夫碱结构增多，但戊二醛浓度过大，水解度呈现变大的趋势。鹿保鑫［20］研究表明戊二醛过量时，交联位点过饱和，体系分子间相对滑动困难，且易产生局部凝胶现象。正是由于这种局部凝胶现象的出现，导致反应的不完全，抵抗酶水解能力减弱。

图1 不同浓度戊二醛改性明胶的水解度Fig.1 The degree of hydrolysis of modified gelatin at various concentration of glutaraldehyde

2.2.2 改性pH对水解度的影响 由图2可知，pH在7.0、7.5水解度比较高，原因可能是在此时明胶与戊二醛反应速度缓慢，而在pH=8.0反应迅速加快，此时的水解度显著性降低（p＜0.05）。李临生［6，21］报道戊二醛的反应活性表现在很宽的pH范围内，这是其他的醛所不能相比的，并且在碱性条件下越容易，而高于9时由于戊二醛本身聚合速度的增加，反应速度反而相对下降。

图2 不同pH下改性明胶的水解度DH（%）Fig.2 The degree of hydrolysis of modified gelatin at various pH values

图3 不同改性温度明胶的水解度Fig.3 Degree of hydrolysis of the modified gelatin at different temperatures

2.2.3 改性温度对水解度的影响 由图3可知，戊二醛与明胶反应随着温度的升高水解度降低，在50℃时达到最低，并且具有显著性差异（p＜0.05），这是由于温度升高，戊二醛与体系大分子间运动加快，而继续增加反应温度，水解度逐渐增大，其原因，邱一鸣［22］认为随着温度的升高，游离态戊二醛含量增多，同时郑学晶［23］研究表明高浓度游离醛易缩聚成较长的大分子链，水分子易进入与明胶蛋白发生交联形成长链分子的交联网格中。正是这种网格结构的增多导致抵抗蛋白酶能力减弱，因此，明胶蛋白与戊二醛反应的最佳温度在50℃左右。

2.2.4 改性时间对水解度的影响 由图4可知，随着改性时间的延长水解度先降低再升高，改性时间在60 min时水解度显著性降低（p＜0.05），并达到最低，林海莉［24］解释为正是反应时间的延长增强了戊二醛与明胶分子上氨基的接触机会，使反应趋向更加充分，形成了较为致密的交联网状结构。当继续延长反应时间，水解度反而升高，李临生［21］报道有人认为戊二醛与伯氨基反应是一个可逆的过程，生成物不稳定。

2.3 均匀实验的结果

图4 不同改性时间的明胶水解度Fig.4 Degree of hydrolysis of the modified gelatin at different times

表3 均匀实验结果Table3 The results of uniform design

采用偏最小二乘回归分析方法对实验结果分析。以戊二醛浓度、改性pH、温度和时间为因变量，借助DPS15.10数据处理系统软件来建立二次多项式回归模型：Y=14.8799351-5.109605X1-0.712393X2-0.244869X3+0.024949X4-0.071656X-0.013488X+0.000108X+0.000077X+0.530187X1X2+0.029836X1X3- 0.001770X1X4+0.023132X2X3-0.009468X2X4+0.000770X3X4

根据数据处理系统所得出的实验处理结果给出了最优指标时各个因素组合，为了验证偏最小二乘回归方程以及实验的可信程度，因此安排一次验证实验，测得各性能指标，如表4所示。

表4 最优指标时各个因素组合与目标函数Table4 Each factor combination and objective function of the optimal index

数据标准化后计算相关系数：误差平方和：0.6035；决定系数R2：0.9329；PRESS统计量：6.4965。说明该模型与实际实验拟合较好，方程在给定的实验范围内有较高的可信度，可用于实际预测。PLS偏最小二乘法回归系数分析各因素对水解度的影响程度大小的顺序为：X3（改性pH）＞X4（时间）＞X2（温度）＞X1（戊二醛浓度）。经拟合得到最佳处理条件为：戊二醛浓度0.9%、pH=6.0、57℃下改性16 min，改性明胶在水解60 min的水解度为4.35%。验证实验证明最佳的戊二醛改性明胶条件下水解度为4.68%，相对误差为7.05%。对比运用数据处理系统所得出来的预测值和进行优化实验的实测值，可以说明偏最小二乘二次回归所建立的二次回归模型是可信的，所建立的模型的优化预测成立。

最优条件戊二醛改性胶的水解度为4.68%，与2.2.1中的未改性明胶的水解度（5.56%）相比，耐酶解能力提高了18.75%。

3 结论与讨论

本实验在单因素实验基础上，运用均匀实验设计软件，得到最佳处理条件：戊二醛浓度为0.9%，pH=6.0，57℃下改性16 min，改性明胶在水解60 min的水解度为4.35%。验证实验证明在此条件下实际水解度为4.68%，相对误差为7.05%。说明经偏最小二乘二次回归所建立的二次回归模型是可信的，所建立的模型的优化预测是成立。与未改性明胶相比较，耐酶解能力提高了18.75%。

戊二醛与明胶蛋白之间的作用受明胶种类、戊二醛浓度、反应pH、温度、时间、反应体系等多种因素影响，本实验采用制球方式，所以水解度的测定结果受球的直径影响较大，因此实验中一定要控制球珠大小在4 mm左右。戊二醛与明胶蛋白之间的改性程度越大，改性后的明胶抗酶解能力显著增强，王咏梅等［25］采用戊二醛、光、热交联三种交联固化方法研究明胶微球包埋hEGF体外释放能力，结果证明：交联程度与体外释放规律密切相关，通过控制交联度可以控制载体的降解速率，从而有效延缓载体的降解速率和包埋介质的释放速度。但是戊二醛与明胶之间的作用机理及产物结构方面存在很大的研究空间，有待于进一步研究。

［l］蒋挺大.胶原与胶原蛋白［M］.北京：化学工业出版社，2006：28-200.

［2］陈秀金，曹健，汤克勇.胶原蛋白和明胶在食品中的应用［J］.郑州工程学院学报，2002，23（1）：66-69.

［3］徐海菊，蔡健，陈江萍.水产胶原蛋白质的基本特性及其在食品加工中的应用［J］.浙江农业科学，2010（2）：324-327.

［4］郑学晶，李俊伟，汤克勇.有机化合物交联改性明胶的研究进展［J］.中国皮革，2012，41（11）：51-53.

［5］李杰.明胶与改性明胶吸附解吸水分的动力学研究［D］.郑州：郑州大学，2010.

［6］李临生.戊二醛与蛋白质反应的特点［J］.中国皮革，1997，26 （5）：12-14.

［7］Bigi A，Panzavolta S，Rubini K.Relationship between triplehelix content and mechanical properities of gelatin films［J］.Biomaterials，2004，25（25）：5675-5680.

［8］Bigi A，Cojazzi G，Panzavolta S，et al.Mechanical and thermalproperties of gelatin films at different degrees of glutaraldehyde crosslinking［J］.Biomaterials，2001，22（8）：763-768.

［9］单志华，郭文宇，孙磊.改性皮胶原的抗酶能力探索［J］.四川大学学报：工程科学版，2003，35（5）：1-5.

［10］Thomposn JI，Czernaszka JT.The effct of two type of crosslinking on some mechnical properties of collagen［J］.Biomed Mater Eng，1995，5（1）：37-48.

［11］寇秀芬，王祯祥.明胶-戊二醛固定化细胞的改进［J］.微生物学报，1987（5）：204-207.

［12］赵新淮，冯志彪.大豆蛋白水解物水解度测定的研究［J］.东北农业大学学报，1995，26（2）：178.

［13］大连轻工业学院，华南理工大学等.食品分析［M］.北京：中国轻工业出版社，2012：216-224.

［14］董宪兵.鸡骨的副产物资源化利用与骨素（肽）风味基料开发的研究［D］.重庆：重庆工商大学，2013.

［15］夏雨，焦志华，刘海英.茶多酚对明胶的改性作用［J］.食品与发酵工业，2011，37（10）：36-40.

［16］沃德A G，考茨A.明胶科学与工艺学［M］.北京：轻工业出版社，1982：537-547.

［17］赵明，王飞俊，韩聪智，等.不同黏度计测试羧甲基纤维素溶液黏度对比研究［J］.纤维素科学与技术，2010，18（4）：38-42.

［18］金勋杰，杨显生，姬烨，等.蛋白胶联剂京尼平与戊二醛的生物学特性比较［J］.中国临床康复，2006，10（25）：60-62.

［19］金勋杰，覃宏昌，曾荣，等.不同浓度戊二醛交联明胶膜特性的研究［J］.药学检验，2006，3（9）：120.

［20］鹿保鑫，王喜刚，周睿，等.戊二醛交联对CCMC/PVC复合膜性能的影响［J］.包装工程，2011，32（9）：1-4.

［21］李临生，张淑娟.戊二醛与蛋白质反应的影响因素和反应机理［J］.中国皮革，1997，26（12）：8-12.

［22］邱一鸣，张英.强化戊二醛消毒液特性分析（一）［J］.广西工学院学报，1998，9（1）：70-73.

［23］郑学晶，秦树法，马力强，等.剑麻纤维增强胶原基复合材料［J］.复合材料学报，2008，25（3）：12-19.

［24］林海莉，曹静，李艳.戊二醛交联明胶膜的制备与性能研究［J］.化学工程与设备，2010，（6）：56-58.

［25］王咏梅，金莉.不同交联方法制备的人表皮生长因子凝胶微球的性能比较［J］.中国生物制品学杂志，2010，23（10）：1138-1140.

Optimizing conditions of the modified gelatin with glutaraldehyde resistant to enzymatic hydrolysis

ZHANG Dan-dan1，BAI Ge1，WANG Lin1，FENG Li-ping1，WEI Bing2，CAO Yan-ping1，2，*
（1.College of Food Science，Beijing Technology and Business Univerisity，Beijing 100048，China；2.Beijing Higher Institution Engineering Research Center of Food Additives and Ingredients，Beijing 100048，China）

Using gelatin as raw material，glutaraldehyde as the modifier，the degree of hydrolysis was studied by single factor test and uniform design.The effects of glutaraldehyde concentration，pH，reaction temperature，time and the interactions of above factors on the degree of hydrolysis were studied.The prediction model of two polynomial regression equation was obtained by using the method of partial least squares regression.The optimal treatment conditions for the enzymatic hydrolysis of glutaraldehyde modified gelatin were as follows：the concentration of glutaraldehyde was 0.9%，pH value was 6.0，the temperature was 60℃and the modified time was 16 min，under which the hydrolysis degree of modified gelatin in 60 min was 4.35%.Results showed that the hydrolysis degree was 4.68%with a relative error of 7.05%by the experiment compare with the above fitting result.Results indicated that the regression equation obtained by the partial least squares regression optimization could guide practical to some extent.Compared with the non-modified gelatin，the anti-enzyme hydrolysis ability of modified gelatin was increased by 18.75%.

gelatin；modified；glutaraldehyde；degree of hydrolysis

TS201.2

A

1002-0306（2016）06-0133-05

10.13386/j.issn1002-0306.2016.06.018

2015－09－29

张单单（1989-），女，硕士研究生，研究方向：固定化酶，E-mail：laisui0911@126.com。

曹雁平（1961-），男，博士，教授，研究方向：食品化学与安全，E-mail：caoyp@th.btbu.edu.cn。

国家自然科学基金项目（31371722）。