微波辅助提取红菇多糖及抗氧化性研究

庞庭才，胡上英，陆媛媛，廖燕星

（钦州学院食品工程学院，广西钦州535099）

微波辅助提取红菇多糖及抗氧化性研究

庞庭才，胡上英，陆媛媛，廖燕星

（钦州学院食品工程学院，广西钦州535099）

以红菇多糖得率为评价指标，采用微波辅助提取法，通过正交试验对红菇多糖提取工艺进行优化，并研究红菇多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基和对DPPH自由基的清除作用。结果表明，微波辅助提取红菇多糖的最佳工艺条件为提取时间6 m in，微波功率240 W，料液比1：25（g：mL），pH 9.0，在此条件下，多糖得率为5.39%。红菇多糖对羟基自由基、超氧阴离子自由基和对DPPH自由基均有明显的清除作用，且清除率随多糖质量浓度增加而增大。

红菇；微波；多糖；抗氧化

红菇（Russula vinosa）又名美丽红菇、大红菇、真红菇，属于担子菌纲，伞菌目、红菇科、红菇属，是一种野生名贵稀有的药食兼用菌［1］。红菇的子实体各个部位特别是菌褶很脆，菌柄短而粗，菌盖常有颜色［2-3］。已有研究发现，红菇中含有丰富的蛋白质、碳水化合物、维生素、氨基酸以及人体必需的各种微量元素［4-5］，其中红菇多糖、麦角甾醇、酸类和杂环衍生物等功能成分，具有降胆固醇、治疗失血性贫血、提高机体免疫力、抗癌、抗炎、增强血管收缩等功效［6-8］。多糖提取工艺主要有酸碱提取法、超声辅助提取、微波辅助提取、复合酶辅助提取以及多种方法的联用。其中微波辅助提取法是利用微波能的加热效应来加速溶剂对固体样品中目标化合物的提取的新技术。史碧波［9］利用微波辅助提取通过正交试验法从鸡油菌中提取多糖，多糖得率为13.55%。李志洲［10］利用微波辅助提取杏鲍菇中多糖，得率可达11.80%。目前，利用微波辅助提取多糖的技术比较成熟，但在用于提取红菇多糖方面的研究还比较少，因此本研究以红菇为原料，采用微波辅助提取法对红菇多糖的提取工艺进行优化，为进一步开发和利用红菇资源提供相应的技术支持。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

红菇：市售；葡萄糖、硫酸、乙醇、苯酚、三氯化铁等（均为分析纯）：上海国药集团化学试剂有限公司。

1.2仪器与设备

HH-4型数显恒温水浴锅：金坛市科析仪器有限公司；EL204型电子天平：梅特勒-托利多（上海）有限公司；ERZA5110A型鼓风干燥箱：上海智诚分析仪器制造有限公司；UV-3200型紫外可见分光光度计：上海美谱达仪器有限公司；H1850型台式离心机：湖南湘仪实验室仪器开发有限公司。

1.3方法

1.3.1工艺流程

红菇烘干→粉碎→原料预处理→回流提取→过滤→澄清液→浓缩液→醇析→洗涤→真空干燥→粗多糖

1.3.2标准曲线的测定

分别吸取0、0.2 m L、0.4 m L、0.6 m L、0.8 m L、1.0 m L的葡萄糖标准溶液（100 mg/L）置20 m L具塞玻璃试管中，用蒸馏水补至1.0 m L。加入1.0 m L 5%苯酚溶液后，快速加入5.0 m L 98%硫酸，静置10 min后振荡10 min，然后将试管放置于30℃水浴20 min，取出冷却至室温，以空白作对照，在波长490 nm处测定其吸光度值，制定葡萄糖标准曲线。

1.3.3多糖提取单因素试验

按一定的料液比加入红菇粉末和设定pH的水，在设定微波功率条件下浸提一定提取时间后，4 000 r/min离心10 min，过滤，滤液加入3倍体积分数为95%乙醇进行沉淀，然后再过滤，将沉淀依次用无水乙醇、丙酮及乙醚多次清洗，沉淀为红菇多糖。将红菇多糖溶于蒸馏水中并定容至1 000 m L后，于波长490 nm处测吸光度值，计算红菇多糖得率。

提取时间的确定：在微波功率320 W，料液比1∶20（g∶m L），pH 7.0的条件下，考察不同提取时间（5 m in、6 min、7 min、8 min、9 min）对红菇多糖提取效果的影响。

微波功率的确定：在提取时间7 min，料液比1∶20（g∶m L），pH 7.0的条件下，考察不同微波功率（80W、160W、240 W、320 W、400 W）对红菇多糖提取效果的影响。

料液比的确定：在微波功率320 W，提取时间6 m in，pH 7.0的条件下，考察不同料液比（1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30（g∶m L））对红菇多糖提取效果的影响。

pH的确定：在微波功率320 W，提取时间6 min，料液比1∶20（g∶m L）的条件下，考察不同pH（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）对红菇多糖提取效果的影响。

1.3.4多糖提取正交试验

在单因素试验基础上，设计L9（34）正交试验，考察提取时间、微波功率、料液比和pH对红菇多糖得率的影响，以确定最佳提取工艺参数。正交试验因素与水平见表1。

表1　红菇多糖提取条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experim ents for Russula vinosa polysaccharides extraction conditions optim ization

1.3.5测定方法

（1）多糖得率的测定

采用苯酚-硫酸法［11］测定单糖含量，再计算红菇样品中多糖得率，其计算公式如下：

式中：W为样品中多糖得率，%；m1为用回归方程计算出的样品测定液的含糖量，μg；V1为样品液的定容体积，m L；V2为测定时移取的样品测定液的体积，m L；m2为样品的质量，g；0.9为校正系数，将葡萄糖含量换算成葡聚糖含量。

（2）羟自由基（·OH）清除率测定

分别加入FeSO4溶液、水杨酸-乙醇溶液，再分别加入不同浓度样品溶液，最后加入H2O2启动反应，水浴离心取上清液，在波长510nm处测定吸光度值，以蒸馏水代替H2O2作为对照组，以蒸馏水代替样品作为空白，计算样品对·OH的清除率［12］。其计算公式如下：

式中：Ai为样品组吸光度值；Ai0为以蒸馏水代替H2O2的对照组吸光度值；A0为以蒸馏代替样品的空白吸光度值。

（3）超氧阴离子自由基（O2-·）清除率的测定

取Tris-HCl缓冲溶液（pH 8.2），加入不同质量浓度（1 mg/m L、2 mg/m L、3 mg/m L、4 mg/m L、5 mg/m L）的多糖溶液，混匀后保温，然后加入邻苯三酚反应后，在25℃水浴中反应4min，加入HCl终止反应，在波长325nm处测吸光度值，以蒸馏水作为对照，计算样品对O2-·的清除率［13］。其计算公式如下：

式中：V1为加入样品后邻苯三酚自氧化速率（以斜率表示）；

V0为加入蒸馏水后邻苯三酚自氧化速率（以斜率表示）。

（4）1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除率的测定

取不同浓度的样品溶液，加入DPPH溶液，避光反应后，在波长517 nm处测定吸光度值，以样品溶液加入无水乙醇作对比，以DPPH溶液加入蒸馏水中作为空白，计算样品对DPPH自由基的清除率［14］。其计算公式如下：

式中：Ai为DPPH+样品的吸光度值；Ai0为样品+无水乙醇的吸光度值；A0为DPPH+蒸馏水的吸光度值。

2　结果与分析

2.1标准曲线的测定

以葡萄糖质量浓度（x）为横坐标，吸光度值（y）为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，结果见图1。

图1　葡萄糖标准曲线Fig.1 Standard curve of glucose

由图1可知，标准曲线回归方程为y=0.006 6x+0.008 5，相关系数R2=0.999 1，表明吸光度值在葡萄糖量为0～100 μg/m L范围内有良好的线性关系。

2.2单因素试验

2.2.1提取时间对红菇多糖得率的影响

图2　提取时间对红菇多糖得率的影响Fig.2 Effect of extraction time on the extrac tion rate of polysaccha rides

由图2可知，随着提取时间的延长，红菇多糖得率也随之升高，在提取时间为7 min时得率达到最大值，之后随着提取时间的继续延长，多糖得率反而呈下降趋势。可能是因为经过一定时间的微波处理之后，样品颗粒内部的温度和压力逐渐提高，导致细胞壁破碎，加快了细胞内物质流出速度。但微波时间也易使多糖分子水解，而致使多糖提取率下降［15］。因此，微波辅助最适时间为7 m in。

2.2.2微波功率对红菇多糖得率的影响

图3　微波功率对红菇多糖得率的影响Fig.3 Effec t of m icrowave power on the extraction rate of polysaccharides

由图3可知，随着微波功率的增大，红菇多糖得率呈先递增后下降的趋势，其中在微波功率240 W时，多糖得率达到最大值。这因为在微波功率＜240 W时，随着温度的逐渐升高，对红菇细胞壁的破坏作用增大，有利于多糖物质的溶出；当微波功率＞240 W之后，由于微波的瞬间加热作用使得红菇细胞中的被处理成分发生了变性，从而阻碍了提取溶剂的渗入，导致多糖物质的得率有效下降［16］。因此，微波最适功率为240 W。

2.2.3料液比对红菇多糖得率的影响

图4　料液比对红菇多糖得率的影响Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of polysaccharides

由图4可知，料液比为1∶10～1∶25（g∶m L）时，红菇多糖得率的上升趋势明显，当料液比＞1∶25（g∶m L）之后，多糖得率趋于下降。可能的原因是适当的溶剂用量，可以增加样品与提取溶剂接触面积和质量浓度差，有利于提取物质的扩散。而随着料液比继续增大，过多的提取溶剂也可能将其他物质溶出，导致多糖得率的下降，同时也会增加后续处理的难度和生产成本［17］。因此，最适料液比为1∶25（g∶m L）。

2.2.4pH对红菇多糖得率的影响

图5　pH对红菇多糖得率的影响Fig.5 Effect of pH on the extraction rate of polysaccharides

由图5可知，随着pH的升高，红菇多糖得率也随之增加，当pH为8.0时，多糖得率达到最大值，之后随着pH的继续增大反而出现减小的趋势。可能的原因是在过酸或过碱性条件下引起多糖糖苷键的断裂，而使多糖发生降解，从而导致多糖得率较低。因此，pH最优选择为8.0。

2.3正交试验结果与分析

在单因素试验的基础上，考察提取时间、微波功率、料液比和pH对红菇多糖得率的影响，结果见表2。

由表2可知，影响红菇多糖得率的各因素顺序为微波功率＞提取时间＞pH＞料液比。由每个因素中K值的大小确定最优方案为A1B2C2D3，即提取时间6min、微波功率240W、料液比1∶25（g∶m L）、pH 9.0。在此条件下进行最优方案的验证试验，红菇多糖得率为5.39%。

表2　红菇多糖提取条件优化正交试验结果与分析Table 2 Results and analysis of orthogonal test fo r Russula vinosa polysaccharides extraction conditions optim ization

2.4多糖抗氧化性研究结果

2.4.1超氧阴离子自由基（O2-·）的清除

图6　红菇多糖对超氧阴离子自由基清除作用Fig.6 Scaveng ing effects of Russula vinosa polysaccharides on superoxide anion radical

由图6可知，红菇多糖对邻苯三酚自氧化具有较强的抑制作用，超氧阴离子自由基清除率随多糖质量浓度的增加而升高，但当质量浓度增大到一定值时，清除率的变化幅度会变小。红菇多糖在此体系表现出很好的清除超氧阴离子自由基的作用，当其质量浓度为5 mg/m L时，对超氧阴离子自由基的清除率达82.3%。

2.4.2羟自由基（·OH）清除能力的测定

由图7可知，红菇多糖对羟自由基有较强的清除作用，清除率随着多糖质量浓度的提高而增大。当红菇多糖溶液质量浓度达到1 mg/m L时其清除率仅为5.7%，而当其质量浓度为5 mg/m L时，其清除率达49.3%，表明了红菇多糖表现出一定的清除羟自由基的效果。

图7　红菇多糖对羟自由基清除作用Fig.7 Scavenging effects of Russu la vinosa polysaccharides on hydroxyl radical

2.4.3DPPH清除能力的测定

图8　红菇多糖对DPPH自由基的清除作用Fig.8 Scavenging effects of Russula vinosa polysaccharides on DPPH radical

由图8可知，红菇多糖溶液具有一定的清除DPPH自由基的能力，清除率随质量浓度的增大而增大，当红菇多糖质量浓度为1 mg/m L时，清除率就达41.1%，而当红菇多糖质量浓度达到5 mg/m L时，清除率就达80.4%，说明红菇多糖能有效的清除DPPH自由基。

3　结论

红菇多糖的提取工艺优化试验结果表明，影响红菇多糖得率的各因素主次顺序为微波功率＞提取时间＞pH＞料液比，最佳提取工艺条件为提取时间6 min，微波功率240 W，料液比1∶25（g∶m L），pH 9.0，在此条件下红菇多糖得率达5.39%。

抗氧化性实验结果表明，红菇多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基和DPPH自由基具有良好的清除能力，最高清除率分别为49.17%、80.35%、82.17%。

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M icrowave-assisted extraction of Russula vinosa polysaccharides and its antioxidant ativity

PANG Tingcai，HU Shangying，LU Yuanyuan，LIAO Yanxing
（College of Food Eningeering，Qinzhou University，Qinzhou 535099，China）

Using Russula vinosa polysaccharides yield as evaluation index，m icrowave-assisted extraction was used to optim ize the extraction process of polysaccharides from R.vinosa by orthogonal experiments.Meanwhile，the scavenging effect of R.vinosa polysaccharides on hydroxyl radical，superoxide radical and DPPH radical were tested.The results showed that the optimal extracting conditions were as follows：extraction time 6 m in，m icrowave power 240 W，solid-liquid ratio 1∶25（g∶m l），pH 9.0.Under such conditions，polysaccharides yield was up to 5.39%.Scavenging effect of R.vinosa polysaccharides on hydroxyl radical，superoxide radical and DPPH radical was obvious，and the scavenging rate increased with the increasing polysaccharides concentration.

Russula vinosa；m icrowave；polysaccharides；antioxidant

O 658

0254-5071（2016）05-0157-05

10．11882/j．issn．0254-5071．2016．05．033

2016-01-10

广西高校科学技术研究项目（2013YB260）；钦州学院校级科研项目（2014XJKY-58C）；钦州学院校级科研项目（2013XJKY-09B）

庞庭才（1985-），男，实验师，硕士，主要从事天然产物研究工作。