半制备型高效液相色谱法分离纯化吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱

秦秀秀， 李爱峰， 孙爱玲， 柳仁民

(聊城大学化学化工学院，山东聊城 252059)



半制备型高效液相色谱法分离纯化吴茱萸中吴茱萸碱和吴茱萸次碱

秦秀秀， 李爱峰， 孙爱玲， 柳仁民*

(聊城大学化学化工学院，山东聊城 252059)

[目的]建立从吴茱萸中分离纯化吴茱萸碱和吴茱萸次碱的半制备型高效液相色谱法。[方法]采用C18柱(250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm)，甲醇-水为流动相，考察了流动相的组成、流速和上样量对分离效果的影响，确定了适宜的色谱条件：流动相为甲醇-水(70∶30,V/V)，流速为25 mL/min，上样量为60 mg，检测波长为225 nm。[结果]一次分离即可得到2种单体成分，经紫外光谱和核磁共振波谱分析得到鉴定为吴茱萸碱和吴茱萸次碱，经高效液相色谱法检测其纯度分别为99.2%和99.7%。[结论]与传统的分离方法相比，半制备型高效液相色谱法具有高效、简便、快速的特点，适用于吴茱萸中主要有效成分的快速制备。

半制备高效液相色谱；分离纯化；吴茱萸；吴茱萸碱；吴茱萸次碱

吴茱萸为芸香科植物吴茱萸 (Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.)、石虎 (Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.var.officinalis (Dode) Huang) 或疏毛吴茱萸 (Evodia rutaecarpa (Juss.) Benth.var.bodinieri (Dode) Huang) 的干燥近成熟果实[1]，具有散寒止痛、降逆止呕、助阳止泻等功效，用于治疗厥阴头痛、寒疝腹痛、寒湿脚气、经行腹痛、脘腹胀痛、呕吐吞酸及五更泄泻[1]。吴茱萸含有生物碱、挥发油、柠檬苦素、黄酮和氨基酸等多种成分[2]，其中最主要的有效成分为吴茱萸碱和吴茱萸次碱，为吴茱萸质量控制的主要指标。

近年来，有关吴茱萸中活性成分分离纯化的研究报道日益增多，其中硅胶柱层析是广泛采用的方法[3-4]，该法可以处理大量样品，但具有不可逆吸附严重、操作繁琐、分离效率低等缺点。也有学者使用高速逆流色谱法分离纯化吴茱萸中的生物碱及柠檬苦素类成分[5-6]，该法虽然消除了不可逆吸附，但在选择两相溶剂系统时由于缺乏理论指导而较为困难。因此，建立一种相关成分的高效分离纯化方法具有十分重要的意义。该文建立了半制备型高效液相色谱法(semi-preparative high performance liquid chromatography,SP-HPLC)从吴茱萸中分离纯化吴茱萸碱和吴茱萸次碱的新方法，一步分离即可得到吴茱萸碱和吴茱萸次碱2种单体成分，利用紫外光谱和核磁共振波谱分析对吴茱萸碱和吴茱萸次碱进行了结构鉴定，利用高效液相色谱法对其纯度进行了测定。

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1仪器。Gelaipu高效液相色谱系统(成都格莱普科技有限责任公司)，包括GLP3250高压输液泵、UV-3292紫外检测器及格莱普色谱工作站；Agilent 1100 高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)，包括G1311A高压输液泵、G1315B DAD检测器、G1332A在线脱气机和Agilent HPLC色谱工作站；Mercury Plus 400 NMR核磁共振仪(美国瓦里安公司)。C18柱(250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm，成都格莱普科技有限责任公司)，Spherigel ODS C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm，大连江申分离科学技术公司)。

1.1.2试剂。用于吴茱萸中有效成分提取的溶剂(乙醇、甲醇)为分析纯(天津市化学试剂三厂)，用于SP-HPLC分离纯化和HPLC分离分析的甲醇为色谱纯(山东禹王实业有限公司禹城化工厂)，实验用水为二次蒸馏水。

1.1.3药材。吴茱萸药材购于聊城市利民大药店，经鉴定为芸香科植物吴茱萸Evodiarutaecarpa(Juss.) Benth.的干燥近成熟果实。

1.2方法

1.2.1粗提物的制备。称取吴茱萸药材500 g，粉碎至30目，用5倍量无水乙醇超声提取3次，每次60 min，将提取液过滤、合并，减压浓缩得粗提物6.0 g，用200 mL甲醇溶解，经0.45 μm滤膜过滤，备用。

1.2.2样品的HPLC分析。色谱柱：Spherigel ODS C18柱 (250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)；流动相:甲醇-水 (75∶25,V/V)；流速：1.0 mL/min；检测波长：225 nm；柱温：室温；上样量：5 μL。

1.2.3SP-HPLC分离纯化。色谱柱：C18柱 (250 mm×25.4 mm,Fuji SMB 100-10填料)；流动相：甲醇-水(70∶30,V/V)；流速：25 mL/min；柱温：室温；检测波长：225 nm；上样量：2 mL (含粗提物60 mg)。在该条件下对吴茱萸粗提物进行分离纯化，在15.7～16.2 min处手动收集第1个馏分，在26.5～27.5 min处手动收集第2个馏分，经减压浓缩除去溶剂。1.2.4化合物的纯度测定及结构鉴定。SP-HPLC分离所得的馏分经HPLC法进行纯度检测，色谱条件见“1.2.2”。化合物的结构经UV及NMR得以鉴定。

2　结果与讨论

2.1HPLC分析条件的优化首先应建立合适的分析方法对吴茱萸药材的提取物和在分离纯化过程中得到的单体成分进行分析。该研究使用Spherigel ODS C18柱(250 mm×4.6 mm I.D.,5 μm)，考察了流动相的组成及洗脱模式对分离效果的影响。结果表明：当使用甲醇-水 (75∶25,V/V) 为流动相，流速为1.0 mL/min时，主要目标化合物可以在较短的时间内获得良好的分离。对主要目标化合物的紫外光谱进行扫描，发现在225 nm均具有较强的吸收，因此选择225 nm 为检测波长。在该条件下，吴茱萸粗提物的HPLC分析图见图1。

注：1为吴茱萸碱；2为吴茱萸次碱。Note:1.Evodiamine; 2.Rutaecarpine.图1　吴茱萸粗提物(a)及2种目标化合物(b、c)的HPLC分析图Fig.1　HPLC chromatograms of the crude extracts from Fructus Evodiae (a) and two target compounds (b,c)

2.2SP-HPLC分离条件的优化

2.2.1流动相的组成。使用C18柱，在上样量为1 mL (含30 mg粗提物)、流动相的流速为25 mL/min，检测波长为225 nm的条件下，考察了流动相的组成对分离效果的影响，结果见图2。

注：a:甲醇-水 (65∶35,V/V)， b.甲醇-水 (70∶30,V/V),C.甲醇-水 (75∶25 V/V)。Note: a.Methanol-water (65∶35,V/V), b.Methanol-water(70∶30,V/V); c.Methanol-water (75∶25 V/V).图2　流动相的组成对分离效果的影响Fig.2　Effects of composition of mobile phase on separation

由图2可知，当使用65%甲醇为流动相时分离度大，但分离时间太长，增大流动相中甲醇的比例可以使分离时间明显缩短，与此同时，吴茱萸碱与其附近的杂质峰之间的分离度也逐渐下降。当使用70%甲醇为流动相时，分离度及分离时间均比较理想，故选择甲醇-水(70∶30,V/V)为流动相。

2.2.2流动相的流速。使用C18柱，甲醇-水(70∶30,V/V)为流动相，上样量为1 mL(含30 mg粗提物)，检测波长为225 nm，考察了流动相的流速对分离效果的影响，结果见图3。

注：a.20 mL/min,b.25 mL/min; c.30 mL/min。Note:a.20 mL/min; b.25 mL/min; c.30 mL/min.图3　流动相的流速对分离效果的影响Fig.3　Effects of flow rate of mobile phase on separation

由图3可知，随着流速的增加，分离时间逐渐缩短，吴茱萸碱与其附近的杂质峰之间的分离度也逐渐下降。当流速为25 mL/min时，分离度及分离时间均比较令人满意，故选择25 mL/min为最佳流速。

2.2.3上样量。采用体积超载的方式，固定样品溶液的浓度为30 mg/mL，通过改变上样体积考察了上样量对分离效果的影响，结果见图4。

注：a.30 mg; b.60 mg; c.90 mg。Note:a.30 mg; b.60 mg; c.90 mg.图4　上样量对分离效果的影响Fig.4　Effects of sampling amount on separation

由图4可知，随着上样量的增加，相邻两组分间的分离度减小，当上样量到达一定量时，相邻组分无法实现分离。当上样量大于90 mg时，吴茱萸碱与其附近的杂质峰分离度较低，无法保证吴茱萸碱的纯度。同时考虑产品的纯度及分离效率，选择上样量为60 mg。

综上所述，使用C18柱分离纯化吴茱萸中活性成分的最佳试验条件如下：甲醇-水(70∶30,V/V)为流动相，流速为25 mL/min，上样量为60 mg，检测波长为225 nm。经过一次分离即可得2种成分，质量分别为25.2 mg和9.4 mg。

2.3化合物的纯度检测及结构鉴定经SP-HPLC分离纯化收集的馏分经减压浓缩后真空干燥，得到黄色和淡黄色粉末，取适量粉末用甲醇溶解，按照“1.2.2”的分析HPLC色谱

条件进行分析，峰面积归一化法检测纯度分别为99.2%和99.7%，HPLC分析图见图1b～c。

化合物的结构经1H-NMR和13C-NMR得到了鉴定，相关数据如下：

化合物1:1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ ppm:8.35 (1H,br,N-H),8.18～7.17 (8H,m,Ar-H),5.96 (1H,s,H-3),4.91,3.32 (1H,each,m,H-5),3.02(2H,m,H-6),2.54 (3H,s,N-CH3);13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ ppm:164.7 (C-21),150.2 (C-15),136.5 (C-13),132.5 (C-17),128.5 (C-18),128.2 (C-19),125.4 (C-2),122.4 (C-16),121.9 (C-8),121.9 (C-10),120.4 (C-20),118.8 (C-11),117.9 (C-7),117.9 (C-9),110.9 (C-12),68.4 (C-3),39.1 (C-5),36.4 (N-CH3),19.3 (C-6)。数据与文献[7]中列出的吴茱萸碱的核磁数据一致，故该化合物鉴定为吴茱萸碱。

化合物2:1H-NMR (400 MHz,CDCl3) δ ppm:9.65(1H,br s,N-H),8.37-8.34 (1H,m,Ar-H),7.19-7.12 (7H,m,Ar-H),4.64 (2H,t,H-5),3.25 (2H,t,H-6)；13C-NMR (100 MHz,CDCl3) δ ppm:162.2 (C-21),147.8 (C-15),145.6 (C-3),138.9 (C-13),135.0 (C-17),127.8 (C-2),127.1 (C-18),126.9 (C-19),126.1 (C-16),121.8 (C-8),121.1 (C-10),121.1 (C-20),120.5 (C-9),120.5 (C-11),118.7 (C-7),112.7 (C-12),41.7 (C-5),20.1 (C-6)。数据与文献[7]中列出的吴茱萸次碱的核磁数据一致，故该化合物鉴定为吴茱萸次碱。

3　结论

`该文使用C18柱，甲醇-水为流动相，通过考察流动相的组成、流速及上样量对分离效果的影响，优化了分离条件，建立了SP-HPLC分离纯化吴茱萸中有效成分的方法。在优化的试验条件下，一次分离可以得到2种高纯度化合物，经UV和NMR鉴定分别为吴茱萸碱和吴茱萸次碱。与传统的分离纯化方法相比，该法具有高效、快速、简便的优点，适合于吴茱萸中主要有效成分的快速制备。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典：2010年版一部[S].北京:中国医药科技出版社,2010:160.

[2] 文丽梅,马超英,余德林,等.吴茱萸的化学成分和药理作用研究进展 [J].中华中医药学刊,2012,30 (9):1976-1977.

[3] 王晓霞,高慧媛,姜 勇,等.吴茱萸化学成分研究 [J].中草药,2013,44 (1):1241-1244.

[4] 张晓拢,经雅昆,彭四威,等.吴茱萸的化学成分研究 [J].天然产物研究与开发,2013,25(4):470-474.

[5] LIU R M，CHU X，SUN A L,et al.Preparative isolation and purification of alkaloids from the Chinese medicinal herbEvodiarutaecarpa(Juss.) Benth by high-speed counter-current chromatography [J].Journal of chromatography A,2005,1074:139-144.

[6] 潘碧妍,吴淳,邢小敏,等.高速逆流色谱法分离制备吴茱萸中的柠檬苦素、吴茱萸碱和吴茱萸次碱[J].世界科学技术：中医药现代化,2011,13(2):310-314.

[7] 陈德昌.中药化学对照品工作手册[M].北京:中国医药科技出版社,2000:103-104.

Separation and Purification of Evodiamine and Rutaecarpine from Fructus Evodiae by Semi-preparative High Performance Liquid Chromatography

QIN Xiu-xiu,LI Ai-feng,SUN Ai-ling,LIU Ren-min*

(College of Chemistry and Chemical Engineering,Liaocheng University,Liaocheng,Shandong 252059)

[Objective] To establish a semi-preparative high performance liquid chromatography (SP-HPLC) method for separation and purification of evodiamine and rutaecarpine from Fructus Evodiae.[Method] A C18column (250 mm×25.4 mm I.D.,10 μm) was used as separation column and methanol-water as the mobile phase.The optimum separation conditions were obtained through investigating the effects caused by the composition and flow rate of the mobile phase and the sampling amount.The suitable conditions were listed as follows:methanol-water (70∶30,V/V) as mobile phase at the flow rate of 25 mL/min,the sampling amount was 60 mg,and the detection wavelength was set at 225 nm.[Result] Under the above conditions,evodiamine and rutaecarpine were obtained through one-step separation.The purities of the two compounds were determined as 99.2% and 99.7% by high performance liquid chromatography (HPLC).The chemical structures of evodiamine and rutaecarpine were identified by ultraviolet spectrum (UV) and nuclear magnetic resonance (NMR) analysis.[Conclusion] Comparing with the traditional separation method,the SP-HPLC method developed in the study has many advantages such as high efficiency,facility,and high speed.And it is suitable for fast preparation of active components from Fructus Evodiae.

Semi-preparative high performance liquid chromatography; Separation and purification; Fructus Evodiae; Evodiamine; Rutaecarpine

秦秀秀(1991- )，女，山东汶上人，硕士研究生，研究方向：药物分离与分析研究。*通讯作者，教授，博士，硕士生导师，从事分离科学研究。

2016-05-30

S 567

A

0517-6611(2016)22-111-03