缺氧诱导因子—1α和M2型丙酮酸激酶在胆管癌细胞中的表达及对糖酵解的影响

张楠　偰光华

[摘要]目的分析缺氧诱导因子-1α和M2型丙酮酸激酶在胆管癌细胞中的表达情况及其对糖酵解的影响。方法分别以不同浓度的氯化钴溶液诱导的缺氧条件下培养胆管癌QBC939细胞，测定并比较培养24h后各组细胞HIF-1α、PK-M2蛋白表达水平和乳酸分泌量。结果缺氧组的HIF-1α、PK-M2蛋白表达水平均显著高于常氧组，胆管癌QBC939细胞24h乳酸分泌量，随氯化钴浓度逐渐增加，且均显著高于常氧培养时分泌的乳酸量，比较差异具有统计学意义（P<0.05）。经Pearson相关分析法分析，PK-M2与HIF-1α呈显著正相关（r=0.436，P=0.002）。结论缺氧诱导因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人胆管癌QBC939细胞中的蛋白表达水平显著提高，且均在胆管癌细胞糖酵解水平的升高过程中发挥重要作用。

[关键词]缺氧诱导因子-1α；M2型丙酮酸激酶；胆管癌；糖酵解

[中图分类号]R735.8 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-34-03

胆管癌是十分常见的一种消化系统恶性肿瘤，发源于胆管上皮细胞，在所有消化系统恶性肿瘤的患者中占到3%，以低分化胆管癌为主，有男性发病率高于女性，60～65岁人群中高发的特点[2-41。本文就氯化钴诱导的缺氧条件下，人胆管癌QBc939细胞中HIF-1α、PK-M2的蛋白表达变化情况进行分析，并探讨其对糖酵解的影响情况。现报道如下。

1资料与方法

1.1一般资料

选择人类胆管癌细胞株OBC939（购自上海和元生物技术有限公司）作为实验细胞株，以氯化钴为缺氧模拟剂诱导缺氧条件。

1.2方法

将购买的在液氮中冻存的细胞进行复苏和传代处理，其中，细胞的复苏主要包括恒温水浴融化、DMSO稀释、离心分离、DMEM培养基（含1%青链霉素以及10%FBS的混合液）加入、细胞培养箱培养等步骤；细胞传代则是在培养皿中的细胞覆盖率达到80%～90%时，用含EDTA的胰蛋白酶消化、细胞悬浮、离心分离后转移并在含完全培养基的培养皿中继续培养，按1：3～1：5的比例传代。再次经消化、分离、悬浮、冷冻后保存。

选取已传3～4代，生长状态良好的胆管癌QBC939细胞接种培养，并行分组处理。常氧培养是在37℃、5%CO₂、饱和湿度的条件下将胆管癌QBC939细胞放入DMEM培养基中进行培养，将其作为对照组；观察组则是将胆管癌QBC939细胞置于含缺氧模拟剂的DMEM培养基中培养，缺氧模拟剂为氯化钴，分设氯化钴浓度为100μmol/L、150μmol/L、200μmol/L、250μmol/L等四，J、组，培养24h后收获细胞，经细胞蛋白提取与浓度测定（BCA法）对不同条件下缺氧诱导因子-1α和M2型丙酮酸激酶在人胆管癌QBC939细胞中的蛋白表达水平进行检测。

同时，收集常氧状态下与缺氧24h后不同小组组内人胆管癌QBC939细胞培养的上清液，采用比色法对其乳酸浓度进行测定，所有操作均严格遵照乳酸浓度测定试剂盒说明书的要求进行，重复6次，收集数据。

1.3统计学方法

数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1不同组别胆管癌HIF-1α、PK-M2的蛋白表达水平比较

比较不同组别胆管癌QBC939细胞中，HIF-1α、PK-M2的蛋白表达水平，可见，观察组的HIF-1α、PK-M2蛋白表达水平均显著高于对照组，比较差异有统计学意义（P<0.05）。其中，HIF-1α蛋白表达量在氯化钴浓度为150μmol/L最高，而HIF-1α蛋白表达量受氯化钴浓度影响较小。经Pearson相关分析法分析，PK-M2与HIF-1α呈显著正相关（r=0.436，P=0.002）。见表1。

2.2不同组别胆管癌QBC939N胞24h乳酸分泌量比较

比较不同缺氧环境下，胆管癌QBC939细胞24h乳酸分泌量，可见随氯化钴浓度增加，乳酸.分泌量逐渐增加，且均显著高于常氧培养时分泌的乳酸量（8.025±1.234），比较差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

3讨论

调查显示，近年来，胆管癌的发病率有不断升高的趋势，由于其发病原因尚不十分明确，治疗中多以手术切除为首选方法，但胆管癌细胞的发病相对隐匿，早期诊断困难，患者就诊时多以发展至晚期，肿瘤恶性度高，且有远处转移、局部浸润情况的发生，有手术切除率低，复发率高，术后生存率低，预后差的情况。在手术切除的基础上辅以化学药物进行综合治疗是比较理想的方法。如何从分子水平上对胆管癌的发生、发展情况进行分析，并采取有效的基因靶向治疗则是肿瘤化疗的新方向。

其中，HIF-1可在肿瘤的缺氧过程中发挥诱导作用，促进VEGF、EPO、PK、HK、LDH等多种关键生长调节因子的表达，参与影响肿瘤能量代谢、侵袭转移、微血管生成、耐受放化疗等过程。而PK则是糖酵解途径中最后一步反应的限速酶，胆管癌组织中血供极差以及供氧不足时呈PK-M2高表达。本研究也发现，在氯化钴诱导的缺氧环境中，HIF-1α、PK-M2蛋白表达水平均显著高于常氧组，同时乳酸分泌量显著增加，提示其均在胆管癌细胞糖酵解水平的升高过程中发挥重要作用，这对于胆管癌相关化疗药物的开发有一定指导意义。吕品等研究了低氧对胆管癌细胞增殖的影响及与HIF-1α表达的关系，同样发现在不同的氯化钴诱导浓度下，胆管癌的细胞增殖、胆管癌细胞周期都受到显著影响，从相关分析曲线上看，在低氧条件处理72h后，会有QBC939胆管癌细胞G1期细胞下降，而s期、G2期细胞增加的情况，且有氧化钴浓度升高，G1期细胞不断下降的表现，HIF-1α表达灰度值变化规律与本文结果基本一致，共同说明了胆管癌细胞糖酵解水平与HIF-1α息息相关。柴浩等对M2-型丙酮酸激酶在胆管癌组织中的表达情况研究中，确定胆管癌组织中PKM2表达明显高于癌旁组织，提示其在肿瘤的发生发展中发挥重要作用，其也与胆管癌细胞糖酵解水平的升高息息相关。