液相色谱-线性离子阱-静电场轨道阱高分辨质谱测定蜂胶中9种黄酮类物质

赵晓亚，王华伟，王 鹏，付晓芳，李 晶，尚吟竹，叶 诚，郑茜玥

(1.湖北出入境检验检疫局技术中心，湖北武汉 430050；2.武汉市洪山区疾病预防控制中心，湖北武汉 430070)

蜂胶为“工蜂采集植物树脂等分泌物与其上颚腺、蜡腺等分泌物混合形成的胶粘性物质”[1]，它是一种有粘性的胶状物质，具有芳香，味苦，低温下变硬、变脆。蜂胶具有复杂而独特的化学组成，其中已被鉴定的有七十多种黄酮类化合物，五十多种芳香酸及芳香酸酯类化合物，二十多种酚类、醇类化合物，十多种醛与酮类化合物，十余种萜类化合物以及五十多种脂肪酸和脂肪酸脂，有钙、硒、锌、铁等三十多种人体必需的微量元素和二十多种氨基酸；还有多种糖类、甾类、酶类、维生素、烯、烃和其它具有生物学活性的有机化合物[2 - 7]。

目前，蜂胶中黄酮类化合物的分析方法主要有分光光度法[8]、液相色谱法[9 - 12]、液相色谱-串联质谱法[11]。线性离子阱-静电场轨道阱(LTQ Orbitrap)高分辨质谱是把线性离子阱多级质谱和高分辨质谱相结合的杂交型质谱仪，具有多种工作模式，可提供详细、高质量的质谱信息，能够对被测化合物的结构做更全面的描述，提高了对复杂基质中被测化合物结构的确证能力。本文采用液相色谱-LTQ Orbitrap高分辨质谱，研究并建立了蜂胶样品中杨梅酮、乔松素、芹菜素、苛因、山奈素、高良姜素、槲皮素、芦丁、桑黄素9种黄酮类化合物的测定及确证方法。研究结果表明，该方法对除杨梅外的8种黄酮类化合物的线性范围为0.5～50 μg/mL,杨梅酮的线性范围为1.0～5.0 μg/mL，其相关系数(r)均大于0.99，在625、1 250和2 500 mg/kg 3添加水平的回收率为78.7%93.3%，相对标准偏差为7.10～12.65%，该方法用于实际样品分析，获得满意结果。

1 实验方法

1.1 主要仪器与试剂

带自动进样器的Finnigan Surveyor液相色谱系统以及Thermo Scientific LTQ-Orbitrap XL组合式高分辨质谱仪(美国，Thermo Scientific)；Milli-Q超纯水器(美国，Millipore)；KQ-600B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；MS2型漩涡振荡器(德国，IKA)；AB204-S型电子天平(美国，METTLER TOLEDO)。

标准品：杨梅酮(Myricetin,CAS 529-44-2) 购自CNW公司,乔松素(Pinocembrin,CAS 480-39-7)和芹菜素(Apigenin,CAS 520-36-5) 购自上海安谱公司，苛因(Chrysin,CAS 480-40-0) 购自TRC公司,山奈素(Kaempferol,CAS 520-18-3)购自国家药品标准物质中心，高良姜素(Galangin,CAS 548-83-4)、槲皮素(Quercetin,CAS 117-39-5)、芦丁(Rutin,CAS 153-18-4) 购自中国药品生物制品检定所，桑黄素(Morin,CAS 480-16-0)购自Chromadex公司。标准溶液：准确称取杨梅酮、乔松素、芹菜素、苛因、山奈素、高良姜素、槲皮素、芦丁、桑黄素标准品各10.0 mg，分别置于100 mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容，配制成质量浓度为100 mg/L标准储备液。分别移取适量的上述储备液到一系列10 mL容量瓶中，用0.1%的乙酸-乙腈溶液(20∶80,V/V)定容，配制成一系列不同质量浓度的混合标准工作液。甲醇、乙腈、无水乙醇均为色谱纯(德国Merck)，乙酸为分析纯。实验用水为超纯水。

实验的蜂胶原料购自于湖北的蜂农。

1.2 样品制备及处理

蜂胶样品于冰箱中-10 ℃左右冷冻过夜，取出后立即搅碎混匀。在室温下，准确称取蜂胶样品0.2 g于25 mL容量瓶内，加入20 mL无水乙醇，温度45 ℃ 超声使样品完全溶解后，用无水乙醇定容。过0.22 μm滤膜，供仪器测定。

1.3 仪器条件

1.3.1液相色谱条件Waters xselect HSS T3柱(100×3.0 mm，3.5 μm)；流动相：(A)0.1%乙酸溶液，(B)乙腈；梯度洗脱程序为：0～15 min，15%～99%B，15～16 min，99%～15%B，16～25 min，15%B；流速 0.2 mL/min；柱温20 ℃；进样量 5 μL。

1.3.2质谱条件质量分析器为FT Orbitrap；正离子模式扫描(ESI+)；质量范围:m/z100～1 000；分辨率:60 000；喷雾电压:4.5 kV；管状透镜电压:80 V，鞘气(N2)压力:241.15 kPa，辅助气(N2)流量:1.98 L/min。

2 结果与讨论

2.1 提取条件的选择

根据文献报道[8 - 13]，蜂胶的提取基本上都采用甲醇、一定比例的乙醇或无水乙醇。在本研究中，试验了甲醇和乙醇作为提取溶剂的提取效率。实验发现，甲醇作为提取溶剂时，样品溶解要比乙醇作为提取溶剂时难一些，而且无水乙醇毒性小，因此选用无水乙醇作为提取溶剂。

2.2 仪器分析条件的优化

分别试验了10 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)溶液-乙腈、10 mmol/L乙酸铵(含0.1%甲酸)溶液-甲醇)、0.1%乙酸溶液-乙腈和0.1%乙酸溶液-甲醇为流动相。实验表明，流动相中含乙腈时比甲醇的分离效果好，而且在0.1%乙酸溶液-乙腈流动相体系中9种被测物分离良好，峰形尖锐，没有拖尾。实验优化了0.1%乙酸溶液-乙腈流动相体系的梯度洗脱条件。发现乙腈的比例对槲皮素和桑黄素的分离影响很大，在本文的流动相梯度条件下，这两种物质能达到完全分离。

质谱方面优化了鞘气电压和辅助气电压，使被测物的响应高。用ToxID筛选软件建立化合物的分子式数据库信息表，并指定离子加合物类型和数量，这里设定正离子模式下可能存在的H+、Na+两种离子。化合物筛选的离子提取窗口宽度为3 ppm。结果显示9种目标化合物的加氢正离子形式被检测到，通过二级碎片离子的设定，增加检测的准确性，方法分离度好，灵敏度高。由于芦丁H+的二级碎片离子较少，Na+离子的二级碎片离子信息丰富，故芦丁进行二级碰撞时是对Na+进行CID。表1给出了9种被测物的精确分子离子及其碰撞能量为40 eV时CID裂解模式下的特征二级碎片离子。图1给出了标准溶液40 eV时CID裂解模式下的二级碰撞谱图。

表1 母离子及碎片离子

2.3 线性关系

分别配制浓度为0.5、1.0、2.5、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的系列标准溶液，按照所建立的分析方法进行测定，以目标组分的峰面积(y)对相应的进样浓度(x,μg/mL)绘制标准曲线，计算各化合物的线性回归方程，9种黄酮类化合物的质量浓度均与峰面积呈线性关系，其相关系数(r)均大于0.99，见表2。图2给出了提取精确[M+H]+离子谱图。对相同浓度的标准溶液在同1 d内的不同时间进行5次重复试验，目标化合物峰面积的相对标准偏差为1.1%～2.0%；对相同标准溶液于10 d内进行重复试验，目标化合物峰面积的相对标准偏差为1.3%～2.5%，质量偏差小于3 ppm，说明采用LTQ-Orbitrap组合式高分辨质谱测定具有很好的稳定性和重复性。

表2 9种化合物LTQ Orbitrap分析的线性回归方程和线性范围

2.4 回收率与精密度试验

称取经测定含量稳定的蜂胶试样0.200 g，平行18份，分别加入高、中、低三种浓度标准混合溶液，充分混匀，按照本实验方法进行测定，结果中扣除试样的含量，回收率与精密度结果见表3。

表3 样品的回收率与精密度(n=6)

2.5 实际样品的测定

应用所建立的方法，对实际的蜂胶样品进行了检测，结果在被检测的蜂胶样品中芦丁和杨梅酮未检测到。9种黄酮化合物在蜂胶中的具体含量见表4。

表4 9种黄酮化合物在实际样品中的含量

3 结论

本文将线性离子阱-静电场轨道肼(LTQ-Orbitrap)高分辨质谱技术引入蜂胶鉴别检测，在进行母离子准确定性定量的同时，增加高分辨的二级质谱，有利于排除干扰，增加定性准确性。该方法具有准确、快速的特点，可用于日常蜂胶中杨梅酮、松属素、芹菜素、苛因、山奈酚、高良姜素、槲皮素、芦丁、桑黄素9种黄酮类物质的定性及定量检测。