巯基化合物近红外小分子荧光试剂的研究进展

张李云，郭小峰，王 红*

(1.武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉 430072；2.中国科学院武汉植物园，湖北武汉 430074)

1 引言

小分子巯基化合物(RSH)是生物体内主要的还原性物质，可清除活性氧和自由基，进而维持机体的氧化还原平衡；生物体内的RSH水平通常在某一范围波动，出现异常时，将会导致肝损伤、阿尔茨海默病、帕金森病、心血管疾病、肿瘤及人免疫缺陷病毒感染等疾病。因此，检测生物体内RSH的含量、含量变化及实时分布对深入研究其生理作用和相关疾病的发生、发展及诊断治疗意义重大。

荧光分析法因其灵敏度高、选择性好、直观、可视化等优势，在RSH分析中应用广泛。RSH本身无荧光或荧光很弱，通常需采用荧光试剂对其衍生后再进行分析，因而对巯基荧光试剂的研究是RSH荧光分析的重点。在近红外光区，生物分子的光吸收小、自发荧光低、拉曼及瑞利散射几乎可以忽略，生物样品中的背景信号较紫外-可见光区大大降低；同时，近红外光激发辐射能量低且组织穿透力强，对细胞及生物体的光损伤小，易获得生物样品的内部结构信息[1,2]。因此，对近红外巯基荧光试剂的开发、应用与日俱增。

有机小分子荧光试剂具有纯度高、保存简单、反应产物单一、重现性好、生物毒性小、生物相容性好等诸多优点，在当前生物样品巯基化合物的荧光分析研究中占主导地位；而荧光团是构成有机小分子荧光染料的核心，能实现近红外激发/发射的荧光团主要有花菁、罗丹明及其类似物、方酸和BODIPY四大类。本文将以此分类，就2010年以来近红外有机小分子巯基荧光试剂的发展进行详细论述。

2 巯基近红外荧光试剂

2.1 花菁类

19世纪50年代，Williams首次合成了花菁染料[3]，这是一类含有奇数碳原子的有机染料，其母体荧光团由杂环聚甲炔共轭体组成，其中杂环并不仅限于吲哚环，还包括喹啉、异喹啉、苯并噻唑及苯并噁唑等。花菁类染料的吸收峰尖、摩尔吸光系数大。母体每增加一个亚乙烯基(-CH=CH-，也称次甲基)，发射波长将红移约100 nm；每增加一个含氮杂环，发射波长红移约20 nm[4]。一般而言，含单个或三个次甲基的花菁染料激发/发射波长在可见光区，而五次甲基花菁(Cy5)和七次甲基花菁(Cy7)的激发/发射波长则进入近红外光区。近红外花菁类染料的设计比较简单，基本遵循上述原则。

花菁染料的荧光量子产率低、光热稳定性差，且随着聚甲炔链的增加容易发生聚合。为此还可采取以下方法对花菁染料的性质进行改良：(1)在次甲基链上引入刚性氯环己烯环，增强花菁染料的稳定性并提高其荧光量子产率[5 - 7]；(2)通过一个或几个亚甲基(-CH2-)使两个花菁染料相连得到BHmC，降低背景荧光干扰，提高检测灵敏度[8,9]；(3)改变聚甲炔基两端的杂环结构得到非对称的花菁染料，如DY-681、DY-731和DY-751等，提高荧光量子产率、增加稳定性且降低细胞毒性[10]；(4)通过偶联吡咯环的方式得到并吡咯花菁染料(PPCy)，延长荧光寿命[11 - 13]；(5)在三羰基花菁中引入乙酰基合成得到乙酰三羰基花菁(CyNA)，使稳定性增加[14]。另外，还可通过引入羧基(-COOH)和磺酸基(-SO3H)等亲水基团[15,16]或与树枝状化合物结合制备树枝状近红外荧光材料[17 - 19]，提高试剂的水溶性和生物相容性，以适于生物样品分析。

2012年，Chen等[20]基于Se-N键断裂的反应特性设计了近红外巯基荧光试剂Cy-NiSe和Cy-TfSe(图1)。由于吸电子基团2-硝基苯基硒或3-(三氟甲基)苯基硒对花菁荧光团的光诱导电子转移(PET)作用，Cy-NiSe和Cy-TfSe的荧光微弱(PBS，pH=7.4)，加入RSH如谷胱甘肽(GSH)后，Se-N键断裂，PET受到抑制，荧光增强(λem=750 nm)。Cy-NiSe和Cy-TfSe对RSH具有选择性响应，可用于细胞或组织中RSH的实时成像分析。

同年，Han等[21]还通过在花菁荧光团上引入多巴胺(Dopamine)，构建了对RSH和H2O2均有响应的“开-关-开”型近红外花菁荧光试剂DA-Cy。DA-Cy在755 nm处有强荧光(PBS,Φ=0.13)，与H2O2反应后，荧光猝灭，生成无荧光的多巴醌化合物O-DA-Cy(Φ=0.002)，O-DA-Cy与GSH发生加成反应生成GSH-DA-Cy(Φ=0.13)，荧光重现，如图2A所示。该课题组将DA-Cy用于如人体肝细胞(HL-7702)等细胞的共聚焦成像(图2B)，对细胞内的氧化还原状态(H2O2/RSH)进行实时监测；他们还利用该试剂对小鼠海马组织成像，直观地展现了H2O2对组织的氧化损伤和RSH对组织的还原修复(图2C)。

2013年，Govindaraju等[22]报道了检测RSH的“turn-on”兼比色型近红外荧光试剂2,4-二硝基苯磺酰花菁(DNBSCy)(图3A)。由于2,4-二硝基苯磺酰基的猝灭作用，DNBSCy本身荧光极低，与RSH反应后，2,4-二硝基磺酰酯基断裂产生七次甲基花菁醌(Cy-quinone)，溶液由浅绿色变成蓝色，在476和581 nm波长处产生新的吸收峰，并在波长700 nm处发射强荧光。DNBSCy已用于监测牛血清白蛋白中RSH的含量，并在谷胱甘肽还原酶和NADPH还原酶存在下监测[GSSG]/[GSH]的动态变化(图3B)。

2014年，Zhang等[23]合成了一个新的检测RSH的NIR花菁试剂CyDNS，该试剂最大的特点即含有一个“氨基甲酸酯”基团，因此，2,4-二硝基苯磺酰酯基团的“S-O”键更易断裂，与RSH的反应速率更快，灵敏度更高；同时，该试剂具有很好的生物相容性，已被用于细胞及活体中RSH的动态监测。

2016年，基于一种新的设计思路，Lin等[24]合成了对目标分析物具有浓度依赖关系的NIR荧光染料CHMC，该染料通过氯取代的花菁和NIR HD染料反应而得(图4A)。CHMC含有两个关键的活性官能团：Cl-和-OH，基于此，通过-OH与2,4-二硝基苯磺酸反应，得到对RSH不同浓度相应的NIR荧光试剂CHMC-thiol(图4B)：2,4-二硝基苯磺酰酯对RSH的高灵敏相应及Cl-基团对RSH的低灵敏相应。

除了以上检测RSH总量的近红外花菁试剂以外，检测单一RSH的试剂也开始出现。2014年Yang等[25]设计合成了选择性检测半胱氨酸(Cys)的近红外花菁试剂Cy-NO2。因p-硝基苯硫酚基团的PET作用，Cy-NO2的荧光受到抑制，当Cys取代p-硝基苯硫酚基团后，荧光生成。由于Cys独特的分子结构使其与GSH、Hcy相区分(图5A)；该试剂被用于监测细胞中的Cys，Cy-NO2与Cys的反应机理及对HeLa细胞的荧光成像见图5B。

2015年，Zhang等[26]报道了一个检测半胱氨酸(Cys)的近红外花菁荧光试剂CyA(如图6A)，该试剂能够对Cys特异性地相应而不受Hcy和GSH的干扰，反应机理如图6A所示，丙烯酸酯作为识别-SH的活性基团，与其发生环加成反应，生成不稳定的中间体，然后内环化为最终产物2，CyA与Cys的反应动力学速率最高，可对细胞中的Cys实时监测(图6B)。

2.2 罗丹明类

自20世纪初Dziewonsky等[27]制备罗丹明染料以来，该类染料在染料激光器、生物标记等方面得到广泛应用。罗丹明染料的摩尔吸光系数大、荧光量子产率高、光稳定性好、激发/发射波长在500 nm以上，是合成荧光试剂的理想荧光团。经典的罗丹明染料如罗丹明B、罗丹明6G、罗丹明19、罗丹明110及罗丹明101等已成为商品化的荧光试剂。为使罗丹明及其衍生物的波长红移，可在罗丹明染料9-位置处连接上吸电子基-CF2和-CN[28,29]、在其母体荧光环上融入杂芳环[30]、用与O原子同一族的S、Se等原子取代罗丹明呫吨环的O原子[31,32]等。但据此得到的罗丹明及其衍生物荧光量子产率较低，难以满足痕量分析的需要。

2008年Qian等[33]首次合成了红色荧光染料Si-焦宁(TMDHS)，其发射波长可达650 nm，荧光量子产率高达0.39(CH2Cl2)、0.18(H2O)，这是因为O原子被Si原子取代后，罗丹明染料的HOMO、LUMO轨道能级改变，能隙差减小、波长红移。受此启发，Nagano等[34,35]以Si等第14族过渡金属原子取代罗丹明呫吨环10-位的O原子，合成了一系列含Si的罗丹明衍生物。这些Si-罗丹明染料不仅保留了母体荧光团的上述优点，而且其激发/发射波长红移至近红外光区。

虽然用于RSH检测的可见光区罗丹明荧光试剂较多[36]，但近红外光区的荧光试剂还鲜有报道。2012年Nagano等[37]以Te-罗丹明为荧光团，合成了近红外荧光试剂2-Me TeR，该试剂利用Te原子的氧化还原特性对活性氧组分(ROS)进行响应。2-Me TeR的荧光量子产率小于0.001，受ROS氧化后，生成强荧光物质2-Me TeOR，其荧光量子产率约0.18；GSH存在时，氧化性的2-Me TeOR又被快速还原为2-Me TeR。2-Me TeR、2-Me TeOR可相互转化并反复可逆地进行，因此已用于监测过氧化氢刺激人体肝细胞(HL-60)产生内源性的ROS和随之生成的恢复细胞平衡的还原性物质如GSH。

2014年Yang等[38]利用呫吨环的螺环化，以2-(7-二乙胺基-2-氧-2H-1-苯并吡喃-3-)-4-(2-羰酰苯基)-7-二乙胺基-1-苯并吡喃鎓(CB)为荧光团，设计了检测Cys/Hcy的比率型近红外类罗丹明荧光试剂，如图7所示。该试剂本身具有强荧光(λex/λem=650/694 nm)，与Cys或Hcy反应后，Cys或Hcy的氨基使其发生关环内酯化，整个荧光团的 “π共轭体系”减小，于λem=474 nm(λex=430 nm)发射强荧光。

2.3 方酸类

1965年，Treibs等[39,40]首次报道了方酸染料，它是具有“供体-π-受体- π -供体”稳定共振结构的两性分子，以方酸环为电子受体、二甲基苯胺为供体。由于其独特的分子结构，方酸染料在近红外光区具有尖而强的吸收峰(ε≥ 105L mol-1cm-1)，在双光子材料、光电晶体管、太阳能电池、非线性光学器件、化学传感器、生物成像、光动力治疗等方面应用较多[41,42]。带有供电子基团的芳香环或杂环原则上都可作为方酸染料的“供体”，如N,N-二烷基苯胺、苯并噻唑、苯酚、甘蓝菊、吡咯、吲哚、喹诺酮等，方酸染料数量较多，详见综述文献[43]。由于方酸染料存在稳定性差、荧光量子产率低(约0.1)等缺点，Smith等[44 - 48]发展了改善方酸染料性质的新方法，即将方酸染料包裹在含有氨基的大环中，有效提高了方酸染料的稳定性。Beverina等对各类方酸染料包括对称方酸染料、不对称方酸染料、大环包裹的方酸染料、方酸聚合物的合成及应用做了详细的总结，具体参见文献[49]。

方酸自出现以来，其近红外激发/发射的特性使其成为构建荧光试剂的理想荧光团之一，检测金属离子、阴离子、H+、小分子、酶、DNA等不同分析物的近红外方酸试剂多有报道，下面仅对近几年来新合成的方酸巯基试剂及其应用展开论述。Wang等[50]合成了含有Hg2+络合基团二-乙硫基-二-乙胺基的不对称方酸试剂(图8)，它与β-环糊精(β-CD)以摩尔比1∶2的比例结合形成复合物，荧光不断增强；该复合物与Hg2+反应后，荧光猝灭。基于巯基化合物与Hg2+的强相互作用，弱荧光的SQ-Hg2+-β-CD作为一个整体可高灵敏地响应水溶液中含巯基的氨基酸，而不受包括组氨酸在内的其它氨基酸干扰。同年，Guang等[51]制备了一种简单快速分析Cys的比色型方酸试剂，二-N-甲基-N-羟基乙基方酸(图9)。该试剂在生理条件下与Cys的反应仅需6 s即可完成。基于该试剂建立的分析方法线性范围在10～700 nmol/L之间，其检出限为3.9 nmol/L，可用于合成氨基酸样品和人血清样品中Cys的测定。

2013年，Pang等[52]利用邻苯二甲醛(OPA)和GSH反应生成的Isoindole -GSH，与方酸染料SQ1构成一个荧光共振能量转移(FRET)体系。Isoindole -GSH在631 nm 和727 nm处分别有两个大的吸收峰，而SQ1在630 nm处发强荧光，两者光谱重叠，组成了一个有效的FRET体系。该FRET体系对GSH有很好的特异性响应，不受Cys、Hcy及常见氨基酸干扰。

2.4 氟硼荧类

1968年，Treibs等[53]首先合成了氟硼荧(二氟化硼-二吡咯甲烷，BODIPY)染料，但直到上世纪90年代中期，这类染料的化学与光学性质才得以彰显。BODIPY的摩尔吸光系数大、荧光量子产率高、光稳定性好，其荧光对溶剂和pH不敏感，母体荧光团的激发/发射波长为490/505 nm[54 - 56]。BODIPY易于化学修饰，通过适当修饰，其衍生物的激发/发射波长可红移至近红外光区。

从2007年以来，关于BODIPY及其衍生物的合成方法和性质研究的报道层出不穷，参见综述文献[54,55,57]。值得一提的是，Shen等[58]从量子化学角度对BODIPY修饰的可能性及不同方法修饰得到BODIPY衍生物的波长变化规律做了详细的探讨。概括而言，使BODIPY衍生物激发/发射波长进入近红外光区的化学修饰手段有：在BODIPY的3-和(或)5-位引入苯乙烯基[54,59-62]、芳基[63]或炔基[64]等共轭基团；合成BODIPY聚合物[65 - 69]；引入构象约束或融合的芳香环[70 - 73]；在BODIPY的meso-位(8)以氮原子取代次甲基[74,75]等。2012年，Jiang等[76]合成了“turn-on”型杂原子BODIPY巯基近红外荧光试剂。该试剂本身荧光很弱(λem=734,Φ=0.03)，与RSH发生亲核取代反应后，2,4-二硝基苯磺酸基团(DNBS)从母体荧光团脱离，荧光增强，对RSH的检出限为5.0×10-7mol·L-1。由于该试剂与Cys的反应迅速，可选择性响应Cys而不受其它巯基化合物尤其是含量最多的GSH的干扰。

2014年，Zhao等[77]设计了meso-位有一甲醛基团(-CHO)、可与Hcy或Cys反应生成稳定的六元环或五元环的BODIPY近红外荧光试剂。在MeCN-H2O(8∶2,V/V)体系中，该试剂的荧光量子产率仅0.06，与Hcy或Cys反应后，荧光显著增强(Hcy:Φf=0.92;Cys:Φf=0.39)。该试剂能快速响应Hcy，而与Cys反应缓慢；因此可通过控制反应时间，对Hcy进行选择性测定。同年，本课题组以苯乙烯基扩大BODIPY母体荧光团的共轭体系，并以碘乙酰胺基作为巯基化合物的识别基团，设计合成了荧光标记试剂1,7-二甲基-3,5-二苯乙烯基-8-苯基-(4′-碘乙酰胺基)-二氟化硼-二吡咯甲烷(DMDSPAB-I，图10)。该试剂本身具有强荧光(Φ=0.557)，巯基衍生产物的荧光量子产率也高达0.560；两者的激发/发射波长均为620/630 nm。同时，试剂和衍生产物还具有光稳定性好、pH耐受范围宽等优点。以此为基础，建立了同时测定生物样品中多种巯基化合物的HPLC[78]和CE[79]等分析方法，检出限分别低至0.24 nmol·L-1和0.11 nmol·L-1。

3 量子点近红外巯基荧光试剂

量子点(Quantum Dots)又叫纳米晶体，它是一种具有表面效应和量子尺寸效应的特殊半导体材料，其光电性能优异[80,81]：光稳定性好、荧光寿命长(30～100 ns)、激发光谱宽、发射荧光颜色多变、半峰宽窄、Stokes位移大(>100 nm)、荧光量子产率高。作为光学材料，适当调节量子点的尺寸、形状或组成，其发射波长将随之发生改变[82,83]。近红外量子点不仅保留了可见光区量子点的所有优点，而且还具有样品干扰少、生物基质穿透力强等光学优势。因此，近红外量子点的研究、开发逐渐成为热点。2014年，Veggel等[84]对近红外荧光量子点的制备、修饰及表征进行了总结阐述。同年，Chen等[85]在概述近红外量子点的合成及表面修饰的基础上，着重对其应用进行了讨论，详细列举了此前应用于生物成像、荧光检测、光伏太阳能电池和电致发光等方面的近红外量子点。

目前，近红外量子点多被用于细胞、组织及生物活体成像，且在肿瘤成像上表现突出[86 - 88]。与此同时，基于荧光猝灭、荧光增强或荧光共振能量转移(FRET)等机理，用于离子、小分子、DNA、蛋白质和酶等多种分析物检测的近红外量子点也有报道[89 - 92]。尽管如此，检测巯基化合物的近红外量子点仍然十分有限。2014年，Wu等[93]通过降低反应物中L-半胱氨酸(L-Cys)的比例，在水相快速合成了近红外CdTe QDs，使之对巯基化合物产生荧光响应，并以此构建了一种基于表面配体缺失的CdTe近红外荧光量子点，为生物样品中的硫醇检测提供了简便经济、高灵敏度和高选择性的新方法。在其它多种氨基酸和生物液体中主要离子、分子共存的情况下，量子点在L-Cys、同型半胱氨酸(Hcy)和谷胱甘肽(GSH)的荧光检测中显示了良好的选择性和灵敏度，检出限(3s)分别为43、 46 和63 nmol·L-1。以此对血清和细胞提取液中的硫醇进行分析,回收率在90%～109%。

尽管近红外量子点的应用日益增长，但其自身存在的缺陷仍不容忽视[94]。首先，量子点多由重金属元素组成，虽然采用表面修饰的方式可降低其生物毒性，但对生物体的影响仍不容忽视；其次，纳米尺寸的量子点较有机小分子而言，空间位阻较大，尤其是近红外量子点，在一定程度上限制了其应用。如结合了抗体的量子点会掩盖一些识别位点，削弱抗原与抗体之间的亲和力，甚至有可能导致抗原与抗体不能结合等。

5 总结与展望

近红外荧光在增加穿透性、降低背景荧光干扰、减少激发光对生物体损伤等方面具有突出的优势，应用越来越广。本综述针对“巯基化合物”这一分析对象，详述了近五年来近红外巯基荧光试剂的发展状况。目前，近红外巯基荧光试剂多用于细胞、组织等样品中巯基化合物的生物成像，且有从选择性较差的总巯基化合物观测向特异性观测某个巯基化合物发展的趋势，这为生物体内巯基化合物的实时检测提供了有效的工具。然而，某些小分子巯基化合物的特异性荧光探针依然欠缺，如辅酶A、半胱氨酰甘氨酸、谷氨酰半胱氨酸等。此外，近五年报道的近红外巯基荧光探针，可与高效液相色谱或毛细管电泳等分离技术相结合的仍然很少，生物样品中多种巯基化合物低背景同时准确定量分析方法选择余地十分有限，同样存在较大发展空间。