流动注射-化学发光法测定亚胺培南的研究

李晓璐，翟 倩，俞宏松，郭 晶，易 钢

(重庆医科大学检验医学院，临床检验诊断学教育部重点实验室，重庆 400016)

亚胺培南是一种既有广谱抗菌活性，又有β-内酰胺酶抑制作用的β-内酰胺类抗生素，对革兰氏阳性、阴性的需氧和厌氧菌具有抗菌作用，其中包括对其他抗生素不敏感或耐药的铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌和脆弱拟杆菌[1]。亚胺培南在临床上应用极为广泛，因此，其质量控制对预防应用过程中不良反应事件的发生具有重要意义。目前,亚胺培南含量的测定方法主要有高效液相色谱(HPLC)法[2 - 5]、亲水相互作用色谱(HILIC)法[6]、分光光度法[7,8]。其中，HPLC法、HILIC法存在操作复杂、分离条件苛刻、分析成本高等缺点，分光光度法方便易行，但其选择性和准确性较低。流动注射化学发光法将传统的化学发光分析法与流动注射技术相结合，不仅使该方法具有灵敏度高、线性范围宽、分析速度快、仪器设备简单[9]等优点，同时克服了传统化学发光分析法反应条件不易控制，试剂消耗大，难以保证样品与发光试剂快速、高度、有效混合等缺点，使得许多传统溶液处理方法的基本操作得以在线、快速、密闭地完成[10]。该方法被广泛的应用于蛋白质、氨基酸等多种生命活性物质的检测以及金属离子、有机化合物等的分析测定，大大提高了生物、医学、药学分析的检测水平。

本研究发现，在碱性介质中，亚胺培南对鲁米诺-K3[Fe(CN)6]化学发光体系有很强的增敏作用，据此建立了流动注射化学发光法测定亚胺培南的新方法，并采用该方法对注射液中亚胺培南含量进行测定，回收率为99.4%～101.8%。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

MPI-B型多参数化学发光分析测试系统(西安迈瑞电子有限公司)；KQ3200DB型数控超声清洗器(昆山市超声仪器公司)；Millipore-Q纯水仪(密理博(中国)公司)。

亚胺培南对照品(大连美仑生物技术有限公司)；鲁米诺、NaOH、 K3[Fe(CN)6]等试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。

1.2 溶液配制

亚胺培南标准储备溶液(4.0×10-4g/mL)：准确称取0.0200 g亚胺培南对照品，用水溶解并定容于50 mL棕色容量瓶中，使用时用水逐级稀释至所需浓度。鲁米诺储备溶液(2.0×10-3mol/L)：准确称取0.0354 g，用0.1 mol/L NaOH溶液逐级稀释。K3[Fe(CN)6] 储备溶液(2.0×10-3mol/L)：准确称取0.0659 g K3[Fe(CN)6]，用水溶解并定容于100 mL棕色容量瓶中，使用时用水逐级稀释至所需浓度。

1.3 实验方法

流动注射化学发光的反应装置如图1所示。实验过程中，从反应装置的a、b、c、d四个流路中泵入的溶液经六通阀(V)在流通检测池(F)中充分混匀并发生明显的化学发光反应，产生的化学信号经光电倍增管(PMT)进行放大检测。该体系的对照信号(流路a为水)记为I0，增敏信号(流路a为亚胺培南)记为Ia，用相对发光强度△I进行定量(△I=Ia-I0)。

1.4 化学发光动力学曲线

精确吸取适量亚胺培南对照品标准储备溶液，用去离子水稀释，分别制得1.0×10-6、2.0×10-6g/mL的亚胺培南溶液。将这两个不同浓度的亚胺培南溶液与空白溶液进行测定，研究亚胺培南-Luminol-K3[Fe(CN)6]体系的化学发光反应动力学性质，结果如图2所示，结果表明：该体系的反应为快速化学发光反应，从试剂混合到化学发光信号达到最大值仅需 7 s，同时可以看出在亚胺培南存在下化学发光信号显著增强。

2 结果与讨论

2.1 仪器参数的优化

实验考察了5～20 s采样时间范围内发光强度的变化，结果表明当采样时间为5 s时，体系的信噪比最大。考察了500～800 V范围内的光电倍增管负高压对相对发光强度和信噪比的影响，结果表明相对发光强度随着负高压的增高而增强，但负高压过高会导致信噪比的下降，因此本实验选择的负高压为600 V。动力学实验证明，该化学发光反应是快速反应，蠕动泵泵速对该化学发光体系有明显的影响。实验考察了蠕动泵泵速对该体系的影响，结果表明灵敏度随着蠕动泵泵速的增加而降低，为了兼顾灵敏度和分析速度，本实验选择的蠕动泵泵速为30 r/min。

2.2 实验条件的优化

2.2.1流路的选择本实验研究了3种反应物顺序：(1)(亚胺培南+鲁米诺)+(NaOH+K3[Fe(CN)6])；(2)(亚胺培南+K3[Fe(CN)6])+(NaOH+鲁米诺)；(3)(亚胺培南+NaOH)+(鲁米诺+K3[Fe(CN)6])，实验结果表明：在第一种进样顺序中，亚胺培南的相对发光强度△I的测定结果最大且稳定。因此选取第一种进样顺序为本实验的最佳流路。

2.2.2碱性介质及其浓度的选择实验分别考察了0.06 mol/L的NaOH、NaHCO3和Na2CO3三种碱性介质对该化学发光体系的影响。结果表明，在NaOH溶液中，相对发光强度最大且稳定，因此实验选择NaOH为碱性介质。考察了NaOH溶液浓度在0.01～0.14 mol/L范围内对△I的影响，结果表明：相对发光强度随着NaOH浓度的增大而增大，当浓度达到0.08 mol/L时相对发光强度较大，浓度继续增大，△I增大幅度减小。因此本实验选择0.08 mol/L的NaOH作为最佳碱性介质。

2.2.3K3[Fe(CN)6]浓度的选择K3[Fe(CN)6]是该化学发光体系中的氧化剂。考察了K3[Fe(CN)6]浓度在1.0×10-5～4.5×10-5mol/L范围内对体系相对发光强度的影响。研究结果表明：△I随K3[Fe(CN)6] 浓度的增大而增大，当浓度达到3.0×10-5mol/L时△I较大，浓度继续增大后△I趋于稳定。因此本实验选择的K3[Fe(CN)6]为3.0×10-5mol/L。

2.2.4鲁米诺浓度的选择考察了鲁米诺在0.2×10-5～1.6×10-5mol/L浓度范围内对相对发光强度的影响。结果表明：△I随鲁米诺浓度的增大而增大，当浓度达到0.8×10-5mol/L时，△I最大，之后△I趋于稳定。因此本实验选取的鲁米诺浓度为0.8×10-5mol/L。

2.3 标准曲线、检测限及精密度

在最佳实验条件下，亚胺培南在4.0×10-8～4.0×10-6g/mL浓度范围内对化学发光的增敏强度△I呈现出良好的线性关系，线性方程为：△I=197.88+3.19×109c，相关系数为0.9987，对浓度分别为2.0×10-6g/mL和2.0×10-7g/mL的亚胺培南进行11次平行测定得到相对标准偏差为1.7%和1.4%。按照IUPAC建议，以3倍空白标准偏差计算出方法的检测限为1.1×10-8g/mL。

2.4 干扰试验

2.5 样品分析

2.5.1生物样本分析取健康志愿者抗凝血浆，测定时，准确称取一定量的亚胺培南，加入到100 μL的血浆中，并稀释至线性范围内，为待测血浆样品。按上述最优实验条件，用所建立的方法进行血浆中亚胺培南的含量测定，回收率为97.3%～101.0%，相对标准偏差均小于1.5%(n=9)。本法可用于血浆中亚胺培南含量的测定。

2.5.2亚胺培南注射液的测定及回收试验采用0.9%的生理盐水溶解亚胺培南将其制成浓度为1.0×10-2g/mL注射液，将注射液稀释至线性范围内，按上述最优实验条件进行流动注射化学发光测定亚胺培南的含量，同时分别按照高、中、低3个浓度水平进行标准加入回收实验。结果见表1。

表1 亚胺培南注射液测定及回收试验

3 结论

本实验利用亚胺培南对鲁米诺-K3[Fe(CN)6]化学发光体系具有的强烈增敏作用，建立了流动注射化学发光法检测亚胺培南的新方法。该方法的检测限为1.1×10-8g/mL，加标回收率在99.7%～101.8%范围。实验结果表明，该方法灵敏度高、分析速度快、线性范围宽、检测限低，可用于亚胺培南含量的测定。