游泳运动对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆和胆碱能神经系统功能的影响

栾海云 李娜王 桂华 许勇

滨州医学院（山东烟台264003）

游泳运动对D-半乳糖致衰老小鼠学习记忆和胆碱能神经系统功能的影响

栾海云 李娜王 桂华 许勇

滨州医学院（山东烟台264003）

目的：探讨游泳运动对D-半乳糖所致衰老小鼠学习记忆和胆碱能系统功能的影响。方法：50只昆明种小鼠随机分成5组：对照组、模型组、15 min/天游泳组、30 min/天游泳组、45 min/天游泳组。除对照组外，所有小鼠连续8周皮下注射D-半乳糖复制衰老模型。运动组小鼠从第5周开始运动，连续4周。Morris水迷宫实验评价小鼠空间学习记忆能力。行为测试结束后，检测小鼠脑组织丙二醛（MDA）含量和超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）活性及皮层和海马组织中乙酰胆碱酯酶（AChE）和胆碱乙酰化转移酶（ChAT）的活性。结果：水迷宫实验结果显示：15 min/天和30 min/天游泳组逃避潜伏期显著短于模型组，目标象限搜索时间百分比、通过目标区域次数均显著多于模型组。酶活性检测结果显示：15 min/天游泳组小鼠脑组织SOD显著高于模型组，GSH-Px活性高于模型组但无显著性，MDA含量显著低于模型组；30 min/天游泳组小鼠脑组织SOD和GSH-Px活性均显著高于模型组、MDA含量显著低于模型组；15 min/天和30 min/天游泳组皮层和海马组织中AChE、ChAT活性均显著高于模型组。结论：15 min/天游泳运动和30 min/天游泳运动均能提高衰老模型小鼠的空间学习记忆能力，其中以30 min/天游泳运动的效果最好，其机制可能与其提高脑组织抗氧化和清除自由基能力，增强中枢胆碱能神经系统功能有关。

游泳运动；D-半乳糖；学习；记忆；胆碱能神经系统

胆碱能神经递质是脑内重要的化学物质，它沿着中膈、海马、基底前脑系统投射到皮质，传导冲动反复出现，使之有可能学习新的知识［1］。研究证实运动能提高机体的认知能力，可预防和延缓衰老引起的记忆减退［2］，加速脑损伤后的恢复，促进患者心理健康［3，4］。运动锻炼是人们日常健身、健心的主要方式，而运动的质量和效果不一，这与运动的强度、方式以及时间有关。国内外关于运动锻炼对D-半乳糖动物认知功能干预的研究甚少。本研究采用D-半乳糖复制衰老模型，通过一系列行为学实验和一些酶活性的检测来评价衰老小鼠的学习记忆能力及运动锻炼能否减轻衰老引起的认知功能障碍。

1　材料与方法

1.1动物分组

昆明种小鼠，50只，雄性，20±2 g，由山东绿叶制药股份有限公司动物中心提供，使用许可证SCXK（鲁）2005-0017。小鼠自由进食饮水，常规分笼饲养，自然光照。所有小鼠在第1周进行3次适应性游泳，随机分成5组，分别为：对照组、模型组、3个运动组：15 min/天游泳组，30 min/天游泳组和45 min/天游泳组。

1.2实验方法

1.2.1给药和运动方式

除对照组外，其他小鼠每日颈背部皮下注射D-半乳糖150 mg/kg，每日1次，连续8周，对照组颈背部皮下注射等体积生理盐水。从第5周开始，对照组和模型组不进行任何游泳训练，将其余游泳组小鼠放入小水箱（80 cm×60 cm×40 cm，水箱四周光滑且高出水面20 cm，无法借力跃出），水温30±1℃，小鼠在水箱中进行无负重游泳训练，每周训练5天，每天1次，分别游泳训练15 min、30 min和45 min，然后休息2天，连续训练4周。游泳结束将小鼠取出，用毛巾擦干，放回笼中。

1.2.2水迷宫实验

在第8周开始进行小鼠空间学习记忆能力测试，参照Morris实验方法［5］进行。实验分为两部分：（1）定位航行实验：测量小鼠对水迷宫空间学习和记忆的获取能力。实验历时5天，第1～4天，每天训练2次。将小鼠面向池壁放入水中，记录小鼠寻找并爬上平台时所需时间（即逃避潜伏期）。如果小鼠在60s内未找到平台，须将其引至平台，让动物在平台上停留10s，这时潜伏期记为60 s。第5天测试小鼠寻找平台潜伏期；（2）空间搜索实验：在第6天撤除水下平台，在同一入水点将小鼠面向池壁放入水中，记录动物在原先放置平台的象限所花的时间（目标象限搜索时间百分比）和进入该象限的次数（通过目标区域次数），作为空间记忆的检测指标。

1.2.3样本采集和指标测定

行为学实验结束24 h后，所有小鼠眼球取血，随后颈部脱臼处死，在冰袋上快速分离全脑。其中每组再从取出的全脑中分离5只小鼠的皮层及海马并称重，每组剩余的5只，只要全脑。分离出的全脑、皮层以及海马，用预冷的生理盐水制成10%的组织匀浆，以转速4000 r·min-1，4℃离心10 min，取上清液分装于离心管中，冷冻保存于-20℃冰箱中待分析。全脑的组织匀浆用于检测抗氧化酶活性，包括谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPx）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）；皮层和海马的组织匀浆用于检测乙酰胆碱酯酶（AchE）和胆碱乙酰化转移酶（ChAT）。GSH-Px、SOD、MDA、AChE和ChAT试剂盒均由南京建成生物工程研究所提供，所有指标测定严格按照试剂盒说明进行。

1.3统计学分析

采用SPSS13.0软件进行数据处理，采用单因素方差分析方法进行差异显著性检验，数据以均数±标准差（±s）表示，以P＜0.05作为判断差异显著性的标准，P＜0.01表示有极显著性差异。

2　结果

2.1小鼠一般状态观察

从第7周开始，对照组小鼠行动活跃，反应灵敏，毛色光滑；而模型组小鼠行动迟缓、毛发枯黄无光泽、自主活动明显降低；游泳运动组与模型组相比有明显改善。

2.2水迷宫实验结果

由表1可见，8周后，模型组小鼠逃避潜伏期显著长于对照组（P＜0.01），目标象限搜索时间百分比、通过目标区域次数显著少于对照组（P＜0.01），说明衰老模型组小鼠造模成功。15 min/天和30 min/天游泳组逃避潜伏期显著短于模型组，目标象限搜索时间百分比、通过目标区域次数均显著多于模型组（P＜0.05，P＜0.01），尤以30 min/天游泳组的效果明显；而45 min/天游泳组小鼠各指标较模型组无显著差异（P＞0.05）。

表1　各组小鼠水迷宫实验中定位航行实验和空间搜索实验结果比较（n=10）

2.3游泳运动对D-半乳糖致衰老小鼠脑组织氧化酶活性的影响

由表2可知，模型组小鼠脑组织中SOD和GSH-Px活性均显著低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），而MDA含量显著高于对照组（P＜0.01）。15 min/天游泳组小鼠脑组织SOD显著高于模型组（P＜0.05），GSH-Px活性高于模型组但无显著性，MDA含量显著低于模型组（P＜0.05）；30 min/天游泳组小鼠脑组织SOD和GSH-Px活性均显著高于模型组、MDA含量显著低于模型组（P＜0.05，P＜0.01），其中尤以30 min/天游泳组的效果明显；而45 min/天游泳组小鼠各指标与模型组相比差异无显著性（P＞0.05）。

表2　各组小鼠脑组织SOD、GSH-Px活性及MDA含量的比较

2.4游泳运动对D-半乳糖致衰老小鼠皮层和海马组织AChE和ChAT活性的影响

由表3可见，模型组小鼠皮层和海马组织中AChE和ChAT活性均显著低于对照组（P＜0.05，P＜0.01）。15 min/天和30 min/天游泳组皮层和海马组织中AChE、ChAT活性均显著高于模型组（P＜0.05，P＜0.01），30 min/天游泳组小鼠酶活性提高更为显著，而45 min/天游泳组与模型组之间无显著差异（P＞0.05）。见表3。

表3　各组小鼠皮层和海马AChE和ChAT活性比较

3　讨论

机体衰老是个复杂的变化过程，研究认为，各种原因引起的自由基损伤、氧化应激和胆碱能神经元的退化等是导致衰老的主要原因［6］。研究表明，运动锻炼有助于延缓人类和动物的脑衰老。Van Praag等的研究证实跑步能促进小鼠海马齿状回的神经再生和学习的长时程增强［7］。Erickson等的研究表明，有氧运动训练可以提高老年人的海马体积，改善记忆功能［8］。长期有规律的适宜运动可促进小鼠的空间学习记忆能力。

脑内胆碱能神经系统损伤及胆碱能神经元丢失是老年性痴呆的主要病理改变，由此导致乙酰胆碱减少是造成学习记忆能力下降的直接原因。老年患者脑中胆碱能神经元缺失、突触前乙酰胆碱的合成降低、胆碱乙酰转移酶的活性和对胆碱的摄取能力明显下降，这些变化与患者的认知功能损害程度呈正相关［9］。AChE和ChAT都是胆碱能神经元的标志酶。AChE可水解乙酰胆碱（ACh），生成乙酸和胆碱，终止神经冲动传递，间接反映ACh代谢；ChAT是合成ACh的关键酶，ChAT活性升高，反映Ach合成、释放、功能的恢复以及胆碱能神经元数量、功能的恢复。

本实验采用D-半乳糖连续8周皮下注射复制衰老模型，小鼠出现行动迟缓、毛发枯黄无光泽、食欲不振、自主活动明显降低。行为学水迷宫实验结果显示，衰老模型组小鼠逃避潜伏期延长，目标象限搜索时间百分比下降，通过目标区域次数减少，说明本实验的模型组小鼠的认知功能下降；15 min/天和30 min/天的游泳运动，可明显改善D-半乳糖致衰老模型小鼠学习记忆功能障碍，同时明显改善衰老小鼠大脑皮层和海马组织内AChE和ChAT活性。表明游泳运动增强衰老小鼠学习记忆功能的机制，可能与其改善衰老小鼠大脑皮层和海马AChE和ChAT活性，恢复AChE和ChAT两者之间的动态平衡，从而提高Ach含量，进而增强中枢胆碱能神经系统的功能有关。

生物体的衰老与自由基代谢失衡有关，许多学者认为氧化应激在衰老发生过程中具有重要作用。自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类具有氧化活性的带负电的离子，自由基的产生和清除的动态平衡与人体的生理、病理、生长发育及疾病、衰老密切相关［10］。D-半乳糖皮下注射后，其代谢产物半乳糖醇不能被进一步代谢而堆积在细胞内，导致细胞肿胀，代谢紊乱，体内活性氧水平升高，过量的氧自由基引起神经元细胞的损伤，造成动物学习记忆能力下降及机体衰老［11］。

抗氧化结果显示，游泳运动可提高衰老模型小鼠空间学习记忆能力，其机制可能与提高脑组织抗氧化和清除自由基的能力，减轻神经细胞膜脂质过氧化有关。本实验结果表明15 min/天和30 min/天运动组均能不同程度升高小鼠脑组织SOD和GSH-Px活性，降低MDA的含量，提示游泳运动能有效地清除衰老机体过多生成的自由基，减轻自由基的损伤效应，进而保护细胞免受氧化损伤，使机体各项生理功能得到明显改善，起到延缓衰老的作用。

总之，游泳运动能改善衰老小鼠学习记忆能力，其机制与促进胆碱能神经系统功能的恢复、清除自由基、减轻氧化应激所致的神经细胞损伤有关。

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The Effects of Swimming Exercise on the Learning，Memory and Cholinergic System in Aging Mice

Luan Haiyun，Li Na，Wang Guihua，Xu Yong
Binzhou Medical College，Shandong，China 264003

Xu Yong，Email：maomx@163.com

Objective To explore the effect of swimming exercise on the learning，memory and cholinergic system in aging mice.Methods 50 mice were randomly assigned to control group，aging control group and 3 aging exercise groups.Except the control group，all mice were injected subcutaneously 150mg/kg of D-galactose once a day for 8 weeks.The mice in the three exercise groups respectively underwent swimming 15 minutes per day，30 minutes per day，and 45 minutes per day for 4 weeks.Morris water maze was used to evaluate the learning and memory ability of the mice.The activities of SOD，AChE，ChAT and GSH-Px，and the level of MDA were determined.Results The escaping latency was longer and the percentage of the time spending in target quadrant and the time going through target quadrant in 15-and 30-minute exercise groups were shorter than the aging control group significantly.The SOD activity was significantly higher and MDA concentration was significantly lower in 15-minute exercise group than in aging control group（P＜0.05）.The SOD and GSH-Px activities were significantly higher and MDA concentration was significantly lower in 30-minute exercise group than in aging control group.Comparing to the aging control group，the activities of AChE and ChAT in the cerebral cortex and hippocampus were significantly improved in exercise group，especially in 30-minute exercise group.Conclusion Exercise 30 minutes per day could significantly improve the learning and memory performances of aging mice induced by D-galactose，probably related to theenhanced ability of brain for against oxidation and for reducing free radicals，and to the improved function of cholinergic nerve system.

swimming，D-galactose，learning，memory，cholinergic system

2014.09.05

许勇，Email：maomx@163.com