核酸适配体功能化纳米复合材料用于靶向凝血酶的心血管疾病治疗

隗予荣， 明瑞杰， 王升富， 袁 荃*

(1.有机功能分子合成与应用教育部重点实验室，湖北大学化学化工学院，湖北武汉 430062；2.生物医学分析教育部重点实验室，武汉大学化学与分子科学学院，湖北武汉430072)

心血管疾病具有高患病率、高致残率、高死亡率以及高医疗风险等特点已经成为重大公共卫生问题。心血管疾病患者容易发生栓塞和卒中等危险，而抗凝剂的溶栓和预防血栓等作用对心血管疾病的治疗起到了非常重要的作用。凝血酶可促进血液凝固，在血管损伤、凝血和血小板激活中起到了纽带的作用。直接抑制凝血酶活性的抗凝剂可以避免其他抗凝剂起效慢以及诸多并发症等缺陷[1]。核酸适配体是一种具有很好应用前景的抗凝剂[2]，且部分核酸适配体已经进入临床试验[3]。凝血酶的一种即由15个碱基组成的核酸适配体(TBA15)可以与其活性位点Ⅰ结合，抑制其活性，因而广泛用于心血管疾病的治疗。但TBA15与凝血酶的亲和力有限[4],不仅抑制效果不够理想，而且目前还缺少针对TBA15的解毒剂。

DNA纳米技术是一种基于DNA的理化特性为原理而构建的新型纳米技术，在生物物理学、生物传感等领域具有广泛应用[5]。邻近表面杂交技术是Landegren等开发的一种特殊DNA纳米技术[6]，他们发现一对核酸适配体在识别同一靶标物时，两条核酸适配体与靶标物三者之间往往趋向于形成一种稳定的闭环结构。Le等利用这种技术实现了蛋白质的超灵敏检测[7]。据文献报道[8]，凝血酶的另一种即由29个碱基组成的核酸适配体(TBA29)与凝血酶结合的亲和力较高，Kd值约为0.5 nmol/L，由于该适配体是与凝血酶的第Ⅱ个活性位点结合，所以没有抑制效果，但是可以基于邻近表面杂交技术使TBA15、TBA29和凝血酶构建成一种稳定的闭环结构来提高TBA15与凝血酶的亲和性，加强抑制效果，从而增强心血管疾病的治疗效果。

贵金属的局部表面等离子体共振效应是金属表面自由电子在电磁场的驱动下表面电荷发生聚集和振荡的过程，该过程可以高效的将光能转化为热能[9]。金纳米棒基于这种性质可以产生良好光热效应[10]。TBA15与凝血酶结合时呈现G -四链体结构，这种结构依赖于G碱基的氢键作用而稳定存在，但是氢键易受温度升高而破坏[11]，因此可以通过金纳米棒的光热效应来破坏TBA15的空间结构从而解除抑制作用来达到解毒的目的。此外，闭环结构中的两核酸适配体的部分双链互补也是通过氢键来维持，光热效应可以使整个闭环结构解体，凝血酶的活性恢复并伴随解毒过程的进行。

图1 凝血酶活性被闭环结构抑制和近红外光释放的原理图Fig.1 Schematic representation of thrombin activity inhibition by the closed-loop structure and release by NIR light stimulation

本文基于邻近表面杂交技术构建了一个稳定的双核酸适配体凝血酶的闭环结构。TBA15和TBA29同时与凝血酶的不同结合位点结合，二者末端的部分序列互补配对而使整体形成一种闭环结构，可以大大增强TBA15与凝血酶的亲和作用，提高抑制效果。由于金纳米棒的光热效应，近红外光的照射可以使这种闭环结构解体，凝血酶的活性得以恢复，从而作为针对TBA15的解毒剂(图1)。纤维蛋白原聚合为纤维蛋白的散射变化以及形成的纤维蛋白的扫描电子显微镜(SEM)的照片均显示该闭环结构较单独的TBA15对凝血酶活性的抑制效果更显著，同时也证明了近红外光刺激下酶活性恢复的可能性。人血清凝血时间测试进一步证明该方法具有非常好的应用前景。此外，模拟透析实验结果表明该方法还可用于除心血管疾病治疗的其它疾病辅助治疗中，例如急性肾功能衰竭病人血液滤过治疗过程中的抗凝与解毒。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

JEM-2100透射电子显微镜(TEM)(日本，JEOL公司)；UV-2500紫外-可见分光光度计(日本，岛津公司)；纳米粒度及Zeta电位分析仪(英国，Malvern 公司)；808 nm红外激光器(陕西凯斯特电子科技有限公司)；F-4600荧光光谱仪(日本，日立公司)；ACL TOP 700全自动凝血分析仪(美国)；MP-2003注射泵(上海雷恩医疗器械有限公司)；JSM-6510扫描电镜(SEM,日本)。

纤维蛋白原购于Sigma Aldrich 公司；人α-凝血酶购于Haematologic Technologies 公司；300 nm羧基修饰的磁球购于武汉珈源量子点技术开发有限公司。凝血酶核酸适配体由ABI 3400 DNA/RNA合成仪合成(美国Applied Biosystems 公司)，并采用高效液相色谱纯化。HAuCl4·3H2O，N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐(EDC)，三(羟甲基)氨基甲烷(Tris)，均购于阿拉丁。其他试剂均为分析纯。实验用水均为高纯水(电阻率为18.25 MΩ·cm)。

核酸适配体序列分别为：TBA15:5′-GGT TGG TGT GGT TGG TTT TTT GTC GTG GGT CT TTTT-SH-3′;TBA29:5′-ACC CAC GAC TTT TTT AGT CCG TGG TAG GGC AGG TTG GGG TGA CT-3′。

1.2 金纳米棒(Au NPs)的制备

金纳米棒的制备方法采用种子生长法[12]。取9.75 mL 0.1 mol/L的CTAB溶液，向其中加入0.25 mL 0.01 mol/L HAuCl4以及新配制的10 mmol/L NaBH4600 μL，混合后室温剧烈搅拌10 min作为种子溶液。另外取一支离心管，加入38 mL 0.1 mol/L CTAB 溶液、2 mL 0.01 mol/L HAuCl4和0.6 mL 0.01 mol/L AgNO3，混合后向其中加入0.21 mL新配制的0.1 mol/L抗坏血酸溶液，剧烈摇晃至无色作为母液。取0.12 mL的种子溶液加入到母液中，并在温度37 ℃反应过夜，制备好的金纳米棒溶液离心并用水洗三次以除去CTAB，沉淀最后分散在水中。

1.3 磁球/金纳米棒(MB/Au NPs)纳米材料的制备

取10 mg/mL羧基修饰的磁球40 μL，加入到1.5 mL的0.1 mol/L MES溶液(pH=6.0)中。然后加入8 mg的EDC和1.2 mg的NHS,溶液在温度37 ℃活化反应15 min。活化后的磁球用磁铁吸到底部，移去上清液，再将溶液分散在1 mL pH=7.4的磷酸盐缓冲溶液(PBS，含150 mmol/L NaCl)中，加入1 mmol/L 400 μL的半胱氨酸于37 ℃反应24 h，得到的半胱氨酸修饰的磁球，用水洗涤三次，分散在1 mL的Au NPs溶液中，并反应24 h。最后使用磁铁分离，将沉淀分散在1 mL的PBS中。

1.4 构建磁球/金纳米棒-闭环结构

取400 μL溶解在生理缓冲液(Tris-HCl缓冲液，25 mmol/L,pH=7.4,150 mmol/L NaCl,5.0 mmol/L KCl,1.0 mmol/L MgCl2,1.0 mmol/L CaCl2)的磁球/金纳米棒溶液，加入10 μL 1 μmol/L的TBA15溶液反应12 h，反应后离心洗涤并分散在400 μL的生理缓冲液中，然后向其中加入2 μL 1 μmol/L 的TBA29和1 μL 0.1 μmol/L的凝血酶溶液，混合液摇床反应2 h。

1.5 不同温度处理磁球/金纳米棒-闭环结构

取400 μL的磁球/金纳米棒-闭环结构溶液，分别在温度45、50、55、60、65 ℃处理10 min，立刻用磁铁处理，取200 μL的上清液，0 ℃预处理20 min，再向其中加入10 mg/mL 5 μL纤维蛋白原，并立刻在荧光光谱仪上测散射信号的变化。

1.6 光热处理磁球/金纳米棒-闭环结构

取400 μL的磁球/金纳米棒-闭环结构溶液于1 mL灭菌的离心管中，用808 nm的激光器垂直照射离心管，选择一定的功率使溶液温度稳定在55 ℃并保持10 min，用磁铁置于离心管底部处理溶液，待上清液澄清后取出200 μL上清液,0 ℃预处理20 min，加入5 μL 10 mg/mL纤维蛋白原溶液，在荧光光谱仪上测散射信号的变化。

1.7 人血清凝血时间测试

向1 mL生理缓冲液中依次加入25 nmol/L凝血酶、250 nmol/L TBA15和400 μL的磁球/金纳米棒-闭环结构溶液，混合均匀后放置在全自动凝血仪上。取健康志愿者血液3 mL，加入333 μL 0.109 mol/L枸橼酸钠溶液后，于3 000 r/min离心3 min以分离血细胞。将处理后的血清放在凝血仪的测试架上进行测量，记录凝血时间。

1.8 模拟透析

在注射泵上接一次性医用输液管来模拟透析过程中的血液管道，利用注射泵推动溶液流动来模拟血液流动。向输液管中加入含有25 nmol/L凝血酶、1 mg/mL MB/Au-TBA15和250 nmol/L TBA29的混合溶液，调节缓冲液的流速为1 mL/h，溶液流动30 min后，取流出200 μL的溶液，加入5 μL 10 mg/mL纤维蛋白原溶液，监测散射变化。溶液取出以后在出液端安装一个永磁铁，使用808 nm的激光器照射永磁铁前10 cm的溶液使温度上升至55 ℃并保持10 min，溶液流经磁铁后溶液中部分磁性纳米颗粒被吸附，收集处理后的溶液，同样取200 μL，加入5 μL 10 mg/mL纤维蛋白原溶液，监测散射信号的变化。

2 结果与讨论

2.1 金纳米棒的合成与磁球/金纳米棒复合材料的表征

图2(a)是金纳米棒连接到磁球表面的方法示意图。以半胱氨酸作为连接剂，羧基修饰的磁球通过酰胺键与半胱氨酸的氨基相连接，金纳米棒通过金硫键与半胱氨酸上的巯基相连，从而使金纳米棒修饰在磁球表面。图2(b)为磁球/金纳米棒的透射电镜(TEM)图，从图中可以看出，金纳米棒尺寸均一，平均长度为37 nm并且均匀修饰在磁球表面；图2(c)显示金纳米棒紫外吸收光谱的最大吸收值在800 nm左右。图2(d)为磁球/金纳米棒制备及后续TBA15修饰过程的Zeta电位表征图，从图中可以看出，羧基修饰的磁球连接半胱氨酸后电位值由-17.9 mV变为-32.1 mV。当CTAB稳定的金纳米棒连接到磁球上面后整体表面的电位值为17.6 mV，进一步修饰上TBA15后，MB/Au-TBA15的电位值变为-20.4 mV。这些电位的变化表明金纳米棒成功修饰在磁球表面，TBA15也成功连接在金纳米棒表面。

图2 (a)金纳米棒修饰在磁球表面的示意图;(b)磁球/金纳米棒纳米颗粒的透射电镜图(标尺:100 nm);(c)金纳米棒的紫外吸收图谱;(d)磁球、半胱氨酸修饰的磁球、磁球/金纳米棒、TBA15修饰的磁球/金纳米棒的Zeta 电位;(e)不同功率的近红外光照射下磁球/金纳米棒溶液的温度变化曲线Fig.2 (a) Schematic illustration of MB NPs functionalized with AuNRs；(b) TEM image of MB/Au NPs(Scale bar,100 nm;(c) Absorption spectrum of AuNPs;(d) Zeta potentials of MB,MB-Cys,MB/Au and MB/Au-TBA15;(e) Temperature rise traces of MB/Au NPs solution under NIR light irradiation with different power

2.2 磁球/金纳米棒-闭环结构对凝血酶活性的抑制效果

图3 未被抑制的凝血酶(a：对照组)和被TBA29(b)、 TBA15(c)以及MB/Au-闭环结构(d)抑制后的凝血酶催化纤维蛋白原聚合的实时监测散射图谱Fig.3 Real-time light scattering spectra of fibrinogen solution treated with uninhibited thrombin(a:Control),thrombin inhibited by TBA29(b),by TBA15(c) and the MB/Au-closed-loop structure(d)

凝血酶可以催化可溶性的纤维蛋白原水解为不溶于水的纤维蛋白，纤维蛋白原对光的散射程度小，但聚合后的纤维蛋白原对光有很强的散射作用，散射程度变化越快表明凝血酶的酶活性越高。TBA15与TBA29分别与凝血酶的不同结合位点结合[13],两种核酸适配体末端部分互补配对可以形成一种闭环结构。这种结构可以增强TBA15与凝血酶的结合作用，从而增强对凝血酶的抑制效果。图3中曲线a、b、c、d分别是未被抑制的凝血酶以及TBA29、TBA15、磁球/金棒-闭环结构抑制的凝血酶催化纤维蛋白原聚合的散射信号变化曲线。曲线b中散射强度增加的速率与曲线a类似，信号增加都很快，表明TBA29对凝血酶活性没有抑制效果，这与文献报道[8]的结果一致。曲线c中散射强度的增加速率比曲线a和b慢，表明TBA15对凝血酶活性有一定抑制效果，曲线c和曲线d散射信号增加速率对比清楚地显示闭环结构对凝血酶的活性抑制效果要远远强于TBA15，表明该闭环结构是比TBA15更加优越的潜在治疗心血管疾病的抗凝剂。

实验进一步利用扫描电子显微镜对比了TBA15和磁球/金棒-闭环结构对凝血酶活性的抑制效果。图4(a)是未被抑制的凝血酶催化纤维蛋白形成的纤维蛋白的扫描电子显微镜照片，图中显示出大面积的网状纤维蛋白。图4(b)是TBA15抑制的凝血酶处理后得到的结果，图中大量絮状纤维蛋白的产生表明TBA15对凝血酶活性有一定的抑制作用。图4(c)是磁球/金棒-闭环结构抑制的凝血酶处理后的结果，图中仅可以看到大量的点状蛋白，几乎没有纤维状，表明凝血酶的活性被显著抑制了，而且磁球/金棒-闭环结构对凝血酶活性的抑制效果远远强于TBA15，这与前面的散射实验的结果是一致的。

图4 (a)未被抑制的凝血酶催化的纤维蛋白原聚合的扫描电镜(SEM)图；(b)TBA15抑制的凝血酶催化的纤维蛋白原聚合的SEM；(c)磁球/金纳米棒-闭环结构抑制的凝血酶催化的纤维蛋白原聚合的SEM图Fig.4 (a) SEM of fibrinogen solution with addition of uninhibited thrombin;(b) SEM of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin by TBA15;(c) SEM of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin by the MB/Au-closed-loop structure

2.3 不同温度处理磁球/金纳米棒-闭环结构后释放出的凝血酶活性研究

图5是不同温度处理闭环结构后恢复的凝血酶催化纤维蛋白原聚合过程的实时散射图。由图中可以看出，45 ℃处理后得到的凝血酶催化纤维蛋白原聚合的散射曲线相对于闭环结构抑制的凝血酶作用的曲线几乎没有变化，表明45 ℃不足以破坏闭环结构。50 ℃处理后凝血酶的活性显著增加。55 ℃处理后得到的凝血酶活性进一步增加，然而当温度超过55 ℃时，得到的凝血酶活性又开始呈下降趋势，这可能是温度过高对酶活性不利引起的。因此，55 ℃处理闭环结构能最大程度恢复闭环结构抑制的凝血酶活性。形成闭环结构会使核酸适配体与底物形成的复合物的熔点升高[14]，有时甚至可以升高30 ℃。TBA15与凝血酶复合物的熔点是46.5 ℃[15]，形成闭环结构后到达55 ℃左右，这与文献报道一致。

2.4 近红外光控制的凝血酶活性恢复研究

图6中曲线a和c分别是未被抑制和被闭环结构抑制的凝血酶催化纤维蛋白原聚合的散射光谱图，图中c的散射变化较a慢，说明凝血酶活性被抑制了。图6中曲线b为近红外光照射后的凝血酶处理的结果，溶液散射强度迅速增加到最大值且斜率与未被抑制凝血酶(图6曲线a)相似，这表明闭环结构的抑制作用在近红外光刺激下被破坏，酶活性得以恢复。上述结果表明近红外光可以作为针对这种闭环结构抗凝剂的高效解毒剂。同样，我们利用SEM研究了这一现象。图7(a)、7(b)分别为近红外光刺激闭环结构前后的凝血酶催化的纤维蛋白原转换后的纤维蛋白的SEM照片。图7(a)中可以看到大量点状蛋白，少量絮状纤维蛋白；而图7(b)中近红外光处理后有大面积絮状纤维蛋白产生，也表明近红外刺激后酶活性得到了有效的恢复。

图5 磁球/金棒-闭环结构经不同温度处理后释放抑制的凝血酶催化纤维蛋白原聚合过程的散射图Fig.5 Real-time light scattering spectra of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin recovered at different temperaturesa:Control;b:inhibited thrombin by the MB/Au-Closed-loop structure;c:45 ℃;d:50 ℃;e,55 ℃;f,60°C;g:65 ℃.

图6 磁球/金纳米棒-闭环结构抑制的以及光热释放的凝血酶催化纤维蛋白原聚合过程的散射图Fig.6 Real-time light scattering spectra of fibrinogen solutions with addition of thrombin inhibited by the MB/Au-Closed-loop structure and thrombin recovered by photo liberation

图7 (a) 磁球/金棒-闭环结构抑制的凝血酶催化纤维蛋白原聚合后的扫描电镜(SEM)图；(b) 光热处理闭环结构后释放的凝血酶催化纤维蛋白原聚合的SEMFig.7 (a)SEM of fibrinogen solution with addition of inhibited thrombin by the MB/Au-Closed-loop structure;(b) SEM of fibrinogen solution with addition of thrombin recovered by photo liberation

2.5 人血清凝血时间测试

正常人凝血时间的范围是9～13 s；由于血液中具有一定的抗凝物质和纤维蛋白原，通过向同一批血液中加入一定浓度的凝血酶测定凝血时间也可以反映凝血酶的活性，凝血时间越长表明酶活性越低。如表1中所示，加入TBA15抑制的凝血酶测血清的凝血时间为12.6 s，稍微比未被抑制的凝血酶测的凝血时间9.7 s长。而磁球/金棒-闭环结构抑制的凝血酶测血清的凝血时间长达43.4 s，是未被抑制的凝血酶的4倍多，表明闭环结构能显著抑制凝血酶的活性。近红外光处理后恢复的凝血时间明显降低到13.9 s，表明凝血酶活性得到了有效的恢复。以上结果表明我们开发的抗凝/解毒方法可以应用到实际样品中，具有潜在的临床应用前景。

表1 凝血时间

2.6 模拟透析实验

连续静脉-静脉血液滤过是重症监护室(ICU)常用的重要治疗方法之一，可用于急性肾功能衰竭、全身炎症反应综合征、多脏器功能衰竭等疾病的救治，在这些血液滤过治疗中同样也需要使用抗凝剂和解毒剂。我们进一步探索了上述靶向凝血酶的调控方法在血液滤过治疗中的应用。图8(a)是设计的透析示意图，TBA15修饰的磁球/金纳米棒以及TBA29被加入到回路中(第1步)，在到达透析器之前与凝血酶形成闭环结构以实现抗凝作用(第2步)。溶液流过透析器以后使用近红外光处理(第3步)，可以破坏闭环结构(第4步)并释放出凝血酶，凝血酶的正常生理活性得到恢复并随即进入体内，而磁球/金纳米棒复合物则可以通过磁铁收集(第5步)。如图8(b)所示，第1步之前未被抑制的凝血酶显示出很快的反应动力学表明凝血酶活性很高，当凝血酶被困于闭环结构中，散射强度增加很缓慢而且没有出现突跃。近红外光处理以后，凝血酶的活性得以恢复，散射曲线能够快速达到平台。这些结果表明，这种抗凝/解凝方法有望应用于急性肾功能衰竭等疾病的血液滤过治疗中。

图8 (a)人工模拟透析示意图；(b)透析过程中凝血酶活性抑制与恢复过程中凝血酶催化纤维蛋白原聚合的实时监测散射图Fig.8 (a)Schematic representation of the artificial dialysis circuit;(b) Real-time light scattering spectra of fibrinogen solution with addition of thrombin solutions from different steps in the dialysis circuit

3 结论

本研究基于邻近表面杂交技术，利用凝血酶的两种核酸适配体与凝血酶构建了一种稳定的闭环结构，增强了适配体对凝血酶的活性抑制效果。在近红外光的刺激下，由于金纳米棒的光热效应，溶液的温度升高使闭环结构破坏并释放出凝血酶，从而恢复酶活性。通过实时监测凝血酶催化纤维蛋白原聚合成纤维蛋白过程中溶液散射强度的变化以及扫描电子显微镜等手段研究了闭环结构对酶的抑制以及近红外光处理的酶活性恢复效果。人血清凝血时间测试表明该抗凝/解毒方法可以应用到实际样品中，具有潜在的临床应用前景。此外，我们还进行了模拟透析实验，结果表明这种抗凝/解毒方法过程有望应用于急性肾功能衰竭领域等疾病的血液滤过治疗中。该靶向凝血酶的抗凝/解毒方法不仅有望用于临床心血管疾病治疗中，还为急性肾功能衰竭等疾病的血液滤过治疗提供新的辅助治疗手段。