人发角蛋白凝胶对L-929细胞的增殖作用研究*

陈剑斌，许少波

(广东省医疗器械研究所/国家医疗保健器具工程技术研究中心，广东 广州 510500)

1 引 言

角蛋白具有良好的生物相容性、可在体外和动物体内生物降解、可促进成纤维细胞粘附和分化、具有较高的机械强度、可自组装等优点，而且源于人发的角蛋白还具有高生物活性、低免疫排异性、来源几乎不受限制等特点，尤其适合应用于再生医学的研究[1]。对人发角蛋白的研究，包括作为神经植入材料、皮肤敷料、涂层材料、人工肌腱、止血材料、支架基材等方面的研究证明，人发角蛋白对包括人角膜上皮、肺上皮、真皮成纤维细胞、成骨及成软骨细胞、神经细胞、骨髓干细胞等都具有明显的增殖促进作用，可以加速多种组织再生[2-3]。使用角蛋白用于软组织填充的研究报道较少，多直接使用人发颗粒进行[4]。为此，我们提取了人发角蛋白，制备成可注射的角蛋白凝胶，并进行了动物皮下植入的实验[5]。本研究评价了该凝胶的吸水性能及对L-929细胞的增殖作用，进一步探讨该材料作为软组织填充材料应用前景。

2 材料和方法

2.1 角蛋白溶解

从理发店收集的人发，经除杂后，使用碱性洗涤剂进行浸泡清洗3次、在50℃下烘干、烘干后的头发按照头发∶三氯甲烷100∶300的比例，在70摄氏度下回流2 h进行脱脂。按照双氧水和氨水1∶3的比例混合后，将头发浸入进行脱色，清洗烘干后剪成1～2 cm的长度备用。

脱色后的头发，按照头发4%，脲45%，SDS2%，巯基乙醇3%的比例在55℃下提取12 h。将反应液在2 500 g下离心(JW1024，安徽嘉文仪器装备有限公司)20 min后，取上层清液置于MWCO 8000-14000Da透析袋(Solarbio)中，按照1∶200的比例采用去离子水透析48 h，期间去离子水每6 h更换一次。透析液置于透析袋中，埋置于聚乙烯醇粉末中进行浓缩，浓缩后稀释成20%的角蛋白溶液在4℃下冷藏备用。

2.2 角蛋白可注射凝胶的制备

20%的角蛋白溶液，经室温开放放置24 h后，可形成角蛋白膜，该膜经研磨过200目筛，取适量粉末装入注射器备用。注射器在使用前，连接过滤孔径为2 um的一次性过滤膜，吸入75%乙醇进行灭菌，反复吸入生理盐水清洗后，排除多余的生理盐水。注射器内粉末呈凝胶状态的微粒，易于直接注射植入。

2.3 SDS-PAGE

采用MiniProtein II 垂直电泳系统(MiniProtein II， BIO-RAD公司)对角蛋白进行分离标记。20%的角蛋白溶液先用纯水稀释至1 mg/ml，然后取100 ul与等量SDS缓冲液混合，煮沸5 min使角蛋白变性，随后放置于冰上。取20 ul冷却的的变性溶液加入预先配置好的5～12%的梯度tris-HCL凝胶中，恒压80 v 30 min后，再调至120 v 100 min。电泳分离后，用纯化水冲洗凝胶5 min，重复两次，然后用考马斯亮蓝R-250染色。将样品与标准蛋白比较。

2.4 傅立叶变换红外光谱

其中：当顶底板投影面积相对差<40%时，V=(S1+S2)×H/2；当顶底板投影面积相对差>40%时，

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2.5 吸水性能

由于注射器中的角蛋白粉末测试吸水率有一定的难度，实验测试角蛋白膜的吸水率反映可注射凝胶的吸水率，如图3(A)是制备的角蛋白膜经过干燥后的吸水率变化曲线，其最大吸水率只能达到320%左右，而未干燥的角蛋白膜B，其含水率为142%左右，对纯水的吸水率可以达到850%左右。A1和A2是A在吸水后重复测试的吸水率变化曲线，B1和B2则是B在吸水后重复测试的吸水率变化曲线，可以看出他们整体上与A的吸水率变化和最大吸水率较为接近。

实验在Shindai 法[6]基础上，经过一定的修改，同样采用巯基乙醇还原人发角蛋白的方法，为避免角蛋白的降解，实验温度控制在55℃，还原12 h，提取率相比Shindai 法的61%～65%稍有降低，接近58%，基本保持了人发角蛋白的三种组分：构成头发中间丝的α-角蛋白(50～65 KD)以及填充中间丝之间的基质蛋白(30KD)[7]。

上述2组吸水后的材料重复2次进行干燥、吸水，测试材料吸水率的变化。

S%=(Swet-S)/ Sx 100%,其中S为膜干燥后的重量,对于组1，S=S1；对于组2，S=S2×W%。

2.6 细胞增殖性能

Mtt比色法可用来定量测量体外细胞的增殖，活力和材料的细胞毒性。小鼠成纤维细胞系l-929(南方医科大学)复苏后置入含血清(杭州四季青生物工程有限公司)的DMEM(美国GIBCOBRL公司)培养瓶培养，凝胶的提取按照标准iso 10993-5的方法，提取液选用纯DMEM培养基，2 g凝胶使用20 ml提取液浸提24 h。阴性对照为纯DMEM培养基，阳性对照为5%二甲基亚砜DMSO溶液。以浸提液和2%体积比的血清为培养介质，每样品各5个复孔，继续培养24、48、72 h后于光学显微镜下观察拍照。各观察期，在细胞拍照后，每孔加入20 ulMTT液，继续培养3 h，小心吸去液体，加入二甲基亚砜DMSO 150 ul/孔，避光振荡10 min，在酶标仪上以570 nm波长测其OD570值。相对细胞增殖率(RCV%)可以从下面公式计算。

从图2中可以看出，人发角蛋白与角蛋白膜的红外光谱均有明显的酰胺Ⅰ带(分别在1656cm-1及1650cm-1处，代表C=O的伸缩振动峰)、酰胺Ⅱ带(分别在1541cm-1及1543cm-1处，代表N-H的变角振动峰)、酰胺Ⅲ带(分别在1215cm-1及1233cm-1处，代表C-N的伸缩振动峰)，表现为典型的蛋白质物质[8]。此外，角蛋白中625 cm-1处的吸收峰是酰胺Ⅳ带O=C-N的变形振动峰，角蛋白膜中687 cm-1处的吸收峰是酰胺Ⅴ带N-H的变形振动峰。

RCV%=(ODTEST/ODCONTROL)×100%

将角蛋白溶液放置表面皿中，-40℃冷冻后冻干(SCIENTZ-10N,宁波新芝)，与人发、角蛋白膜分别研磨后，分别与溴化钾混合压片，在400 到 4000 cm-1之间测试红外(布鲁克BRUKER TENSOR 27)

3 结果与讨论

3.1 SDS-PAGE分析

图1为提取的角蛋白SDS-PAGE图，中间2条为样品角蛋白溶液的条带，左右两侧为标准蛋白，通过对照，提取的人发角蛋白的三条普带，分别对应于标准蛋白的30、50和 65 KD三部分，其中65 KD的角蛋白分布较窄，其余两个组分的条带相对较宽，而50 KD位置的颜色相对较深。

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图1 人发角蛋白SDS-PAGE图

3.2 红外

随着生活水平的不断提高，人们越来越讲究均衡营养，一些高脂肪食物已在市场销售中遭遇冷淡，而一些“素”、“粗”、“杂”的蔬菜、野果与五谷却日益受到青睐，野菜、野果、人造植物肉、蔬菜制品、高梁、玉米、大豆等已成为人们饮食中必不可缺少的食物。吃粗防病、吃杂亦补，吃素益寿的观念正在流行起来。

对比人发的红外谱图发现，酰胺Ⅱ带特征峰和酰胺Ⅲ带特征峰的位置变化不大，说明这两处的分子基团及其振动种类未发生变化。而人发红外谱图中2876 cm-1和2962 cm-1处的红外吸收峰在角蛋白中则变化为2962 cm-1和2924 cm-1处，发生该变化的主要原因是因为人发角蛋白提取过程中，头发中的二硫键(-CH2-S-S-CH2-)发生断裂，C-H中C的电子云密度降低，使C-H的伸缩振动谱带向低波数移动。另外，角蛋白中985 cm-1处的吸收峰代表了胱氨酸残基C-S的特征吸收峰，1043 cm-1处的吸收峰为S=O的对称伸缩振动峰，这两处吸收峰在人发红外谱图中均未出现，说明了人发中的一部分二硫键基团转化成了磺酸根[9]。由此可见，实验从头发中提取的人发角蛋白溶液，仍具有多肽特征。

图2 人发和人发角蛋白的红外谱图

3.3 吸水性能

实验对角蛋白膜进行吸水性能的测试，用于间接反映角蛋白水凝胶的水合性能。将直接制备的角蛋白膜分成2组，组1在40℃真空下烘干，计算含水率W%， 组2 则不经烘干处理，两组均在称重(S1,S2)后室温下浸入纯水中，在不同时间后取出，去除多余的水分后再次称重(Swet)。吸水率S%的计算按照以下公式:

实验结果可以为控制人发角蛋白凝胶的吸水率提供依据，制备的膜或粉末在未完全干燥的状态下，会保持较高的吸水率或膨胀率。若控制干燥程度，势必影响凝胶的吸水率，从而为凝胶的应用提供依据。实验也发现，相对于A在20～30 min接近最大吸水率，B膜只需要10 min即可接近最大吸水率，说明完全干燥的角蛋白材料，吸水溶胀的速率要小于完全干燥的材料。相对于报道的角蛋白海绵吸水率(367%～554%)[10]，不干燥角蛋白膜有着更高的吸水率，而且所有膜的吸水速率均大于海绵，海绵材料需要20 h以上的时间能达到溶胀平衡。

图3 角蛋白膜的吸水过程

3.4 细胞增殖

小鼠成纤维细胞系L-929在对照溶液、角蛋白提取液以及阳性对照中的细胞生长情况见图4，总体来看细胞在对照溶液、角蛋白提取液中的数量逐步增加，且细胞形态正常，少量的死亡细胞呈现圆形且亮度明显，符合细胞的正常代谢。而阳性对照组细胞几乎全部死亡，呈现出规则圆形和少量细胞碎片。利用测试的OD570值经过计算，角蛋白浸提液的RCV%在三个测试期的平均增值率分别达到119%、122%和123%。

FeOx掺杂对CeO2纳米晶催化甲烷选择氯氧化反应性能的影响 …………………何洁丽，严 亚，杨 蓉，李婧炜（48）

图4 不同实验阶段L-929细胞形貌

人发角蛋白的细胞相容性和对细胞的增殖已经被很多研究证实，Francesca T等[11]分别制备了人发角蛋白的涂层和水凝胶，采用L929小鼠成纤维细胞对该角蛋白水凝胶(涂层)和胶原I型水凝胶(涂层)进行对比实验，角蛋白比胶原成倍的提高了细胞的粘附、增殖和细胞的生存能力。Stephan[12]通过对12种细胞进行培养发现，受角蛋白膜材料作用的细胞中，有9种表现出优异的增殖现象。

作为动物植入实验的前提，我们对自行制备的角蛋白凝胶的细胞毒性进行了验证。实验结果表明，仅仅72 h的培养，人发角蛋白已表现出明显的促进细胞增殖作用。考虑到该实验是在37℃下对角蛋白凝胶只进行了24 h的浸提，由于角蛋白的交联作用，浸提液在受凝胶作用较弱的状态下，可达到对L929 10%左右的促进增殖作用，可以预见该材料与细胞的长期作用将会更加明显。

4 结论

实验采用一种新的方式，制备的人发角蛋白可注射凝胶，具有较高吸水率，良好的细胞相容性，并可促进细胞增殖。由于未使用其他交联剂，该材料可在体内快速降解。作为一种同种异体材料，人发角蛋白凝胶有望在皮肤创伤及其他软组织缺陷修复方面获得进一步研究和应用。