一株假单胞菌降解间甲酚的特性研究★

石高科 王 孟 贾子龙

(1.诸暨市规划设计院，浙江 诸暨 311800； 2.太原理工大学环境科学与工程学院，山西 太原 030024)



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一株假单胞菌降解间甲酚的特性研究★

石高科1王 孟2贾子龙2

(1.诸暨市规划设计院，浙江 诸暨 311800； 2.太原理工大学环境科学与工程学院，山西 太原 030024)

假单胞菌，间甲酚，生物降解，反硝化

含酚废水产生于石油化工、煤气、炼焦、印染等生产工艺中，间甲酚是酚类污染物的代表物质之一，常用作防腐剂、除草剂、杀菌剂、有机溶剂等，具有较高的毒性，在较低浓度时便会对人类和环境造成严重威胁。尽管间甲酚对微生物有极强的抑制作用，但仍有众多学者分离出具有较高降解间甲酚能力的微生物，主要包括Citrobacter farmeri[1]，Lysinibacillus cresolivorans[2]，Bacillus cereus[3]，Brevibacillus borstelensis[4]等。

近年来，好氧反硝化现象不断被发现，好氧反硝化菌的分离及其反硝化性能的研究得到了迅速发展，利用好氧反硝化菌进行生物脱氮，突破了传统理论的认识，为生物脱氮技术提供了全新的途径，大大降低了投资费用和运行成本。目前已报道的好氧反硝化菌包括Pseudomonas sp.Y2-1-1[5]，Pseudomonas stutzeri[6]，Diaphorobacter sp.PDB3[7]等。

1 材料和方法

1.1 菌种和培养基

假单胞属细菌Pseudomonas sp.BN5从活性污泥中分离得到[8]。

LB培养基(g/L)：胰蛋白胨10，酵母浸出粉 5，NaCl 10，pH 7.2，用高压蒸汽灭菌锅在121 ℃下灭菌20 min。

无机盐培养基(g/L)：NaNO30.15，KH2PO40.5，K2HPO40.5，MgSO4·7H2O 0.2, CaCl 0.1，MnSO4·H2O 0.01，Na2MoO4·2H2O 0.01，Fe2(SO4)3·H2O 0.01，pH 7.2，用高压蒸汽灭菌锅在121 ℃下灭菌20 min。

用0.2 μm孔径纤维膜过滤间甲酚，在接种前加入培养基中。

1.2 实验方法

1)间甲酚降解及反硝化特性。考察Pseudomonas sp.BN5对不同初始浓度间甲酚的降解情况、细胞生长及反硝化特性。间甲酚初始浓度为0 mg/L～300 mg/L，各浓度培养基设置一个没有接种菌的空白对照，以消除底物挥发造成的影响。

2)细胞粗酶液提取。将菌株分别接种至含100 mg/L间甲酚的无机盐培养基和不含间甲酚的LB培养基中，用摇床在30 ℃，180 r/min下培养至对数生长后期，取10 mL菌液，在4 ℃，10 000 r/min下离心10 min，收集菌体，用磷酸盐缓冲液(pH=7)清洗菌体两次，重悬细胞后置于冰水混合物中，用超声破碎仪(型号JY92-IIN)破碎细胞，离心20 min，收集上清液，即为粗酶液。

1.3 测试与分析方法

2 结果与讨论

2.1 间甲酚降解及酶活分析

图1为细胞生长和间甲酚降解曲线。间甲酚降解同步于细胞生长，随着时间的延长，间甲酚的利用率提高，并于对数生长期达到最大。菌体Pseudomonas sp.BN5分别在30 h，42 h和58 h内降解100 mg/L，200 mg/L及300 mg/L的间甲酚，随着间甲酚浓度升高,底物抑制作用增强，降解难度增大。

细胞生长半对数曲线的斜率表示细胞比生长速率。如图1所示，随着间甲酚浓度的提高，细胞生长的延滞期增长，细胞比生长速率降低，菌株处于对数生长期时，细胞浓度快速增长。随着间甲酚浓度的增加，最终细胞浓度也相应提高。菌体降解300 mg/L苯酚只需18 h，比降解同质量浓度间甲酚缩短40 h，表明间甲酚比苯酚难于降解。

菌株对间甲酚的最大降解能力考察见图2。当间甲酚浓度从320 mg/L上升到360 mg/L时，由于底物浓度增加，菌体生长的延滞期逐渐增长，底物降解所用的时间也延长。在初始间甲酚浓度为400 mg/L的培养基中，菌体生长十分缓慢，间甲酚的降解速率也一直较低，经过90 h降解后，培养基中间甲酚的降解量仅为初始总浓度的31%；100 h后菌体增长基本停滞，间甲酚浓度也不再降低，因此，菌株Pseudomonas sp.BN5对间甲酚的最大降解能力为360 mg/L。

在有氧条件下，间甲酚被羟化生成邻苯二酚，接着邻苯二酚-1,2-双加氧酶或邻苯二酚-2,3-双加氧酶催化邻苯二酚邻位或间位开环，产物最终经降解途径进入三羧酸循环。测定菌株Pseudomonas sp.BN5粗酶液中C12O和C23O的活性，结果如表1所示。在唯一碳源为间甲酚的无机盐培养基中，菌体粗酶液中C23O比活力为0.065 U/mg蛋白质，C12O比活力仅为0.005 U/mg蛋白质，因此该菌株降解间甲酚以间位开环为主。菌体破碎后上清液中C23O的活性远高于未破碎菌体上清液中酶活性，表明该酶为胞内酶。以LB培养基(不含间甲酚)为基质的两种上清液中均未检测到酶的活性，说明该菌株C23O是诱导酶。

表1 不同基质中邻苯二酚双加氧酶活力

2.2 菌株的好氧反硝化特性

2.3 间甲酚降解动力学

鉴于间甲酚抑制细胞生长，采用Haldane方程描述细胞生长动力学，方程为:

(1)

其中，μmax为细胞最大比生长速率，h-1；S为限制性底物浓度，mg/L；Ks为饱和常数，mg/L；Ki为抑制常数，mg/L。

选取初始浓度为0 mg/L，20 mg/L,40 mg/L，60 mg/L，80 mg/L，100 mg/L，150 mg/L，200 mg/L，300 mg/L，360 mg/L的间甲酚。用Matlab软件将数据进行最小二乘拟合，所得拟合曲线如图5所示，模型预测与试验数据吻合良好。动力学参数为：μmax=0.202 h-1，Ks=9.85 mg/L，Ki=101.91 mg/L，决定系数R2=0.989。从图5可见，随着间甲酚浓度升高，细胞比生长速率μ先增大后减小，μ在间甲酚浓度约40 mg/L时达到最大；随着间甲酚浓度继续增大，μ逐渐降低，底物抑制作用增强，当间甲酚浓度小于40 mg/L并逐渐降低时，μ迅速降低，这是由于培养基中缺乏足够的碳源，底物限制作用占主导地位。

3 结语

1)菌株Pseudomonas sp.BN5能够以间甲酚为唯一碳源、能源生长，其降解间甲酚的最大能力为360 mg/L，高浓度间甲酚对菌株生长有一定的抑制作用，且间甲酚浓度越高，抑制作用越强。代谢机制研究表明，间甲酚可诱导该菌合成邻苯二酚-2,3-双加氧酶，从而使间甲酚发生间位裂解。

3)细胞生长动力学符合Haldane方程，动力学参数为：μmax=0.202 h-1，Ks=9.85 mg/L，Ki=101.91 mg/L，决定系数R2=0.989。间甲酚浓度约40 mg/L时，细胞比生长速率达到最大。

菌株Pseudomonas sp.BN5能在好氧条件下进行高效反硝化，并具有较高的降解酚类化合物的能力，可应用于实际含酚废水处理，同时达到脱氮除碳的目的，这可为今后高效降解酚类污染物工艺的设计与开发提供理论依据。

[1] 彭丽花,任 源,邓留杰,等.间甲酚降解菌Citrobacter farmeri的降解特性及代谢途径解析[J].环境化学,2015,28(1):44-48.

[2] 李 婷,任 源,韦朝海.固定化Lysinibacillus cresolivorans的PVA-SA-PHB-AC复合载体制备及间甲酚的降解[J].环境科学,2013,34(7):2899-2905.

[3] 于晨阳,毛 缜.蜡状芽孢杆菌菌株SMC的间甲酚降解特性及动力学[J].化工进展,2015(5):1453-1458.

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[5] 孔庆鑫,李君文,王新为,等.一种新的好氧反硝化菌筛选方法的建立及新菌株的发现[J].应用与环境生物学报,2005,11(2):222-225.

[6] 李卫芬,傅罗琴,邓 斌,等.1株好氧反硝化菌的分离鉴定及反硝化特性研究[J].环境科学,2011,32(8):2403-2408.

[7] 王国英,崔 杰,岳秀萍,等.异养硝化—好氧反硝化菌脱氮同时降解苯酚特性[J].中国环境科学,2015,35(9):2644-2649.

[8] 李 媛.一株异养硝化—好氧反硝化苯降解菌的分离鉴定及特性研究[D].太原：太原理工大学,2015.

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The characteristic study of m-cresol biodegradation by Pseudomonas sp.★

Shi Gaoke1Wang Meng2Jia Zilong2

(1.ZhujiPlanning&DesignInstitute,Zhuji311800,China; 2.CollegeofEnvironmentScience&Engineering,TaiyuanUniversityofTechnology,Taiyuan030024,China)

Pseudomonas sp., m-cresol, biodegradation, denitrification

1009-6825(2016)24-0127-04

2016-06-14★:国家自然科学基金资助项目(项目编号：51378330,51408396)

石高科(1984- )，男，工程师； 王 孟(1991- )，男，在读硕士； 贾子龙(1988- )，男，在读硕士

O625.311

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