青花菜花球及叶片中硫代葡萄糖苷组分及含量分析

马越　丁云花　刘光敏

摘要：对12个青花菜（Brassica oleracea L. var. botryti L.）品种的花球及叶片中的硫苷含量及组成进行了分析测定，结果表明，青花菜中含有9种硫代葡萄糖苷，分别为3-甲基硫氧烯丙基硫苷（IBE）、2-羟基-3-丁烯基硫苷（PRO）、2-丙烯基硫苷（SIN）、4-甲硫基-3-丁烯基硫苷（RAA）、3-丁烯基硫苷（NAP）、4-羟基吲哚基-3-甲基硫苷（4OH）、3-甲基吲哚基硫苷（GBC）、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（4ME）、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（NEO）。青花菜花球中的硫苷含量是叶片中的1～5倍不等，不同品种之间存在差异性。RAA是青花菜中含量最多的硫苷组分。

关键词：青花菜；花球；叶片；硫代葡萄糖苷

中图分类号： S635.301 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）07-0300-04

青花菜（Brassica oleracea L. var. botryti L.）属于十字花科芸薹属甘蓝种的变种，为一、二年生草本植物。硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GLS，简称硫苷）是一类含硫化合物，是十字花科蔬菜中重要的次生代谢产物。所有的十字花科植物都能够合成硫代葡萄糖苷，硫代葡萄糖苷存在于这些植物的根、茎、叶、种子中[1]。由于侧链R 基团的不同，可把硫苷分为脂肪类、芳香类、吲哚类硫苷3类。硫代葡萄糖苷及其降解产物具有多种生物活性、化学活性，硫代葡萄糖苷已被证实与十字花科蔬菜的风味及营养成分、植物自我保护机制以及人类的身体健康有着密切关系。蔬菜在被食用或机械破碎时，其中所含的硫苷被内源芥子酶水解成多种具有生理活性的降解产物，产物之一的异硫氰酸酯能够有效预防癌症，尤其是膀胱癌、结肠癌和肺癌[2-4]。青花菜富含3-甲基硫氧烯丙基硫苷（glucoiberin）、4-甲基硫氧丁基硫苷（glucoraphanin）、3-甲基吲哚基硫苷（glucobrassicin）以及1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（neoglucobrassicin）[5]。英国科学家已选育出高硫苷含量的青花菜新品种，该品种的抗癌能力是普通青花菜的80 倍[4，6]。不同蔬菜种类或同一蔬菜种类的不同品种、不同生长环境以及同一植株的不同生长阶段、同一植株的不同部位硫苷的含量及组分都存在差别[7-10]。本研究对我国市场上常见的12个青花菜品种的花球、叶片的硫苷含量及组成进行了测定，结合青花菜栽培性状及产量等进行分析，旨在对青花菜育种及副产物综合利用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

供试的12个青花菜品种来自北京市农林科学院蔬菜研究中心（表1）。2013年2月1日播种，3月25日定植于北京市农林科学院蔬菜研究中心通州农场，采用露地直播方式，株距50 cm，行距 50 cm，重复3 次。7月24日取新鲜的花球及叶片测定硫苷含量。

1.2 方法

1.2.1 硫苷的提取[11] 取新鲜青花菜花球及叶片，分割成小球或小片，在真空冷冻干燥机内干燥。称量粉碎好的样品0.2 g，放入15 mL塑料管中。加入内标TRO（苯甲基硫苷）0.25 mL，迅速加入100%预热的甲醇，80 ℃下水浴20 min，每隔4～5 min涡旋振荡1次，3 000 r/min离心10 min，取上清液倒入15 mL塑料管中，放在冰盆中。沉淀物继续用70%甲醇提取2次，同上述处理方法，合并上清液，即为样品液。取一次性注射器，加入玻璃棉，塞紧，放在试管上。加入DEAE胶溶液2 mL，用2 mL双蒸水洗涤，加入样品液2 mL。待样品液不再滴下，加入0.02 mol/L NaAc溶液。待不再有液体滴下，将注射器转移到另一试管上，加入75 μL硫酸酯酶溶液，封口过夜。将过夜的注射器用双蒸水洗涤3次，每次 0.5 mL。用注射头挤压注射器，使液体尽可能转移到试管中。将试管中液体通过0.45 μm滤膜转移到小玻璃瓶中，冷冻保存，待用。

1.2.2 硫苷的分析 HPLC分析条件：Nova-Pak C18色谱柱：3.9 mm×150 mm，50 μm，检测波长229 nm，流速 1.0 mL/min，常温，进样量20 μL，梯度洗脱如表2所示。A液：1 g四甲基氯化铵（TMACl）溶于2 L双蒸水中，混匀，抽滤。B液：1 g四甲基氯化铵（TMACl）溶于1.6 L双蒸水中，加入400 mL色谱纯乙腈，混匀抽滤。

采用苯甲基硫苷作为内标，根据保留时间和峰面积测定硫苷组分。利用内标和响应因子计算硫苷含量，硫苷含量计算公式如下：

硫苷含量=脱硫硫苷峰面积×内标量×脱硫硫苷相对响应因子内标峰面积×试样质量。

2 结果与分析

2.1 青花菜中硫苷组分

根据不同保留时间以及特征峰形，可以鉴定得到：3-甲基硫氧烯丙基硫苷（glucoiberin，IBE）、2-羟基-3-丁烯基硫苷（progoitrin，PRO）、2-丙烯基硫苷（sinigrin，SIN）、4-甲基硫氧丁基硫苷（glucoraphanin，RAA）、3-丁烯基硫苷（gluconapin，NAP）、4-羟基吲哚基-3-甲基硫苷（4-hydroxyglucobrassicin，4OH）、苯甲基硫苷（glucotropaeolin，TRO，内标）、3-甲基吲哚基硫苷（glucobrassicin，GBC）、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（4-methoxyglucobrassicin，4ME）、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（neoglucobrassicin，NEO）（图1）。

2.2 不同青花菜品种中总硫苷含量

由图2可以看出，不同青花菜品种间花球及叶片中总硫苷含量差异较大。青花菜花球中，中绿1号的硫苷含量最高，为23.53 μmol/g DW；其次是贡献者，含量为 23.03 μmol/g DW；含量最低的是大帝，为9.19 μmol/g DW。青花菜叶片中，中绿9号总硫苷含量最高，为 10.11 μmol/g DW；其次为中绿5号，为9.86 μmol/g DW；含量最低的是南秀366号，仅为1.93 μmol/g DW。总体而言，青花菜花球中的硫苷含量是叶片的1～5倍不等，不同品种之间存在差异性。

2.3 不同青花菜品种中硫苷组分的分析

目前已从自然界中分离鉴定出120多种硫苷，不同十字花科作物中的硫苷组分不同，其中在芸薹属蔬菜中发现了 15～20种硫苷[12]，青花菜中已报道的则有16种[5]。本试验对12 个青花菜品种的花球和叶片中的硫苷组分进行了测定，共检测出9种硫苷组分（表3、表4）。这9 种硫苷分属于脂肪类、吲哚类，没有检测出芳香类硫苷。

由表3可以看出，9种硫苷组分中，RAA在青花菜花球中含量最多，占硫苷总含量的20.14%～69.42%。南秀366号总硫苷含量为13.31 μmol/g，但RAA含量为9.24 μmol/g，在所有品种中占比最高。野绿总硫苷含量为21.55 μmol/g，但其中RAA仅为4.34 μmol/g，仅占总含量的20.14%。结果表明，不同青花菜栽培种对RAA硫苷在总硫苷含量中所占的比例有影响，这与Schonhof等的检测结果[13]一致。Abercrombie等研究发现，连续2年青花菜双单倍体（自交种）亲本形成的双列杂交群体中，RAA含量呈现显著的常规遗传结合力，但没有发现显著的特殊遗传结合力，常规遗传结合力均方约为特殊遗传结合力均方的14倍，表明常规结合力在预测杂交产生的RAA含量方面比特殊结合力更重要，因此一个给定的自交种与其他自交种结合将产生相对可预测RAA含量的杂交种[14]。青花菜花球是主要的可食部位，因此，青花菜潜在的保健作用主要取决于所选择的栽培品种。

由表4可以看出，RAA在青花菜叶片硫苷组分中占比最高，占总含量的9.33%～56.57%，其中中绿6号总硫苷含量9.25 μmol/g DW，RAA含量为4.76 μmol/g DW；南秀366号总硫苷含量为所有品种中最低，仅为1.93 μmol/g DW，其中RAA占比也最低。叶片的用途与花球不同，叶片是青花菜的副产物，可以作为饲料进行再利用。研究表明，含有β-OH的硫代葡萄糖苷能降解生成2种能导致甲状腺肿大的产物：异硫氰酸盐和唑烷-2-硫，它们通过不同的方式作用于动物或人体的甲状腺造成危害[3-4]。PRO是对营养价值不利的主要硫苷组分[15]。从表4可以看出，PRO占总硫苷含量从1189%～42.83%不等，其中幸运品种PRO含量为0.88 μmol/g DW，硫苷总含量为7.4 μmol/g DW，幸运品种的叶片最适宜进行饲料加工。

青花菜是十字花科蔬菜中4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷（glucoraphanin，RAA）含量最丰富的蔬菜之一[16]。RAA是萝卜硫素前体，萝卜硫素已被证实是迄今为止发现的最强烈的phaseⅡ酶诱导剂，能降低食道癌、结肠癌、乳腺癌等多种癌症的发病率[2-5，17-19]。其他硫苷的同源异硫氰酸盐的抗癌功效也有报道，如 3-甲基吲哚基硫苷（glucobrassicin，GBC）的水解产物吲哚-3-甲醇能够调节生物转化酶的活性，从而抑制乳腺癌、前列腺癌细胞的活性[20-21]。

不同蔬菜和品种中硫苷含量的差异可以归结为基因型不同[22]，同时受环境因素的影响。Farnham等对生长在3个不同环境下的9种不同基因型的青花菜硫苷含量进行了研究，发现环境对硫苷含量影响显著，RAA是唯一显著受基因型影响的硫苷，对RAA含量的影响因素中，基因型效应占528%，基因型和环境互作效应小于基因型[10]。本试验中所有青花菜品种均生长在同一环境中，栽培条件基本相同，因此硫苷含量差异主要取决于品种本身基因差异。

3 结论

本研究结果表明，青花菜中检测到9种硫代葡萄糖苷，分别为3-甲基硫氧烯丙基硫苷（IBE）、2-羟基-3-丁烯基硫苷（PRO）、2-丙烯基硫苷（SIN）、4-甲硫基-3-丁烯基硫苷（RAA）、3-丁烯基硫苷（NAP）、4-羟基吲哚基-3-甲基硫苷（4OH）、3-甲基吲哚基硫苷（GBC）、4-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（4ME）、1-甲氧基吲哚基-3-甲基硫苷（NEO）。这9种硫苷分属于吲哚类与脂肪类，没有检测到芳香类硫苷。其中4-甲硫基-3-丁烯基硫代葡萄糖苷是青花菜中的主要硫苷。南秀366号花球中RAA含量占比最高，叶片中RAA含量占比最低，具有潜在的应用前景。

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