虹鳟鱼源气单胞菌的药物感受性及变化

文/王小亮 徐立蒲 王静波 王姝 曹欢 张文 王澎

虹鳟鱼源气单胞菌的药物感受性及变化

文/王小亮 徐立蒲 王静波 王姝 曹欢 张文 王澎

本文从北京市两家虹鳟鱼养殖场的发病鱼体上共分离出25株疑致病性气单胞菌，其对磺胺类药物呈现较高的耐受性，耐药率均在84%以上。虹鳟鱼源气单胞菌对盐酸多西环素和氟喹诺酮类药物较为敏感，耐药率均低于10%；其中盐酸多西环素为最敏感的药物，敏感率为100%。氟苯尼考易使病原菌短时间产生较高的耐药性。研究表明不同种类的菌株对抗菌药物的感受性不同，同种菌的不同菌株之间对抗菌药物的感受性也不同，需要针对具体样品及时检测，依据检测结果指导养殖者合理使用抗菌药物，才可能取得较好的效果。

当前，细菌性疾病是危害鱼类养殖的最主要的生物源性疾病。防治细菌性疾病的主要手段是使用化学药物，但在使用过程中药物滥用问题突出，主要表现在轻预防重治疗和滥用药物。针对药物滥用突出问题，已经引起各相关部门、学者的高度关注。并开展了相关的基础理论和应用技术研究。北京市水产技术推广站自2009年开始在鱼类病原菌的耐药性方面开展研究和应用，筛选了适合北京市养殖鱼类主要病原菌的分离、鉴定、保种方法以及病原菌药物感受性检测方法。

本文旨在通过开展虹鳟鱼气单胞菌的药物感受性普查，获得虹鳟鱼源气单胞菌对渔用抗菌药物感受性及其变化的基础数据，了解和掌握抗菌药物的使用对气单胞菌耐药性的变化规律，指导虹鳟鱼养殖者科学合理使用渔用抗菌药物。

一、材料和方法

1.材料

（1）菌株

2015年4月至2015年10月，从北京怀柔区顺通虹鳟鱼养殖中心和卧佛山庄养殖有限公司饲养的虹鳟鱼体内分离到25株气单胞菌，其中嗜水气单胞菌8株、温和气单胞菌9株，杀鲑气单胞菌8株。菌株详细信息见表1。

表1.虹鳟鱼源气单胞菌来源

（2）仪器和试剂

超低温冰箱（MDF-382，日本SANYO公司）、生化培养箱（LRH-150B，上海一恒公司）、细菌浊度计（WGZ-2-X，上海昕瑞仪器仪表有限公司）、PCR仪（Mastercycle Gradient，德国Eppendorf公司）、电泳仪（DYY-6C，北京六一仪器厂）、凝胶成像系统（IS-3400， Alpha Innotech 公司）。

Mulluer-Hinton肉汤（MHB）和RS琼脂购于北京陆桥技术有限责任公司，脑心浸液肉汤培养基（BHI）和脑心浸液琼脂（BHIA）购于英国OXOID公司。盐酸多西环素、氟苯尼考、甲砜霉素、盐酸诺氟沙星、乳酸诺氟沙星、磺胺嘧啶钠、磺胺二甲氧嘧啶钠、新诺明等9种抗菌药物为原料药。

2.方法

（1）采样方法

采样方法为固定每月中旬采样1次，在虹鳟鱼发病时，及时采集样品；未发病时，取池塘中游动缓慢的鱼（不少于6尾）和原池水装入高压聚乙烯袋，加冰块，立即运回实验室。采集样品时，记录渔场的发病情况、发病水温、用药情况、鱼类死亡情况等信息。

（2）病原菌分离、鉴定方法

取4尾病虹鳟鱼，分别无菌操作取肝、肾组织块，首先接种于脑心浸液肉汤（BHI），然后在脑心浸液琼脂（BHIA）划线分离。前者22℃增菌24小时～48小时，然后采用RS琼脂划线分离，选择黄色、圆形、微凸且有芳香性气味的菌落进行纯化。后者于22℃培养72小时，若出现产褐色素的菌落，则分离纯化。

纯化的菌落采用API鉴定系统进行鉴定，如为气单胞菌，则采用BHI在适宜温度增菌16小时～20小时，-80℃保存。若产褐色素的菌落，PCR 扩增16S rDNA基因，测序判定为杀鲑气单胞菌，则增菌后-80℃保存。

（3）菌株的药物感受性检测方法

药敏检测借鉴美国临床实验室标准委员会制定的《抗微生物药物敏感性试验执行标准（2010年）》，采用其中的浓度梯度稀释法（定量法），培养温度调整为28℃，敏感线依同类药物界定，自定标准内没有的抗菌药物的敏感线。不同种类抗菌药物的溶剂及界定的敏感线见表2。

表2.水产用抗菌药物的溶剂及界定的敏感线

（4）结果记录和数据统计

结果记录为将加菌的药物浓度梯度管与对应的未加菌的药物浓度梯度管比较，肉眼观察试管中培养基变浑浊，即为未抑制菌生长，反之，为抑制菌生长。将抑制菌生长的试管中药物浓度最低的值最为最小抑菌浓度（MIC），记录该药物抑制检测菌的MIC值。

耐药率=（高于耐药MIC值的菌株数÷总检测菌株数）×100%，加权平均MIC=∑（菌株数×对应的MIC值）/菌株总数。

二、结果

1.疾病种类及用药情况

在监测期间，虹鳟鱼发生的主要病害临床症状主要表现为：眼突出、眼溃烂、水霉、疥疮等，其中由杀鲑气单胞菌引起的疾病和不明病因病造成的经济损失最为严重，杀鲑气单胞菌病造成的经济损失约500kg。其中，顺通养殖场的虹鳟在4月份发生突眼病，采用过氟苯尼考和嗯诺沙星，使用时间3天，使用剂量均为10mg/kg鱼。在6月13日发生杀鲑气单胞菌病（后确诊），连续使用7天氟苯尼考，剂量约为20mg/kg鱼；使用3天嗯诺沙星，剂量约为15mg/kg鱼；后采用盐酸土霉素和三黄粉。9月初，发生不明病因病，使用氟苯尼考，剂量约为15mg/kg鱼。两个养殖场采用的药物种类和总用量如下：聚维酮碘8箱（500mL/瓶，20瓶/箱），盐酸土霉素10kg，氟苯尼考2.5kg，盐酸恩诺沙星5kg，三黄粉8.8kg。并且调查发现两个虹鳟鱼养殖场曾连续多年使用氟苯尼考。

2.虹鳟鱼源气单胞菌对抗菌药物的感受性总体情况

总体上，北京市虹鳟鱼源气单胞菌对磺胺类药物耐药最为严重，耐药率均在84%以上，耐药浓度在512g/mL以上；其次是氟苯尼考和甲砜霉素，耐药率约为60%，耐药浓度在30g/mL以上。耐药率低于10%的药物种类为乳酸诺氟沙星、烟酸诺氟沙星和盐酸多西环素，耐药率分别为8.0%、4.0%和0%。详见表3。

表3.虹鳟鱼源气单胞菌对抗菌药物的感受性分布表

3.不同种类病原菌对抗菌药物的感受性

从表4可以看出，不同种类的菌株对抗菌药物的感受性不一样，如嗜水气单胞菌对乳酸诺氟沙星的耐药率达25.0%，而温和气单胞菌和杀鲑气单胞菌的耐药率为0%。温和气单胞菌对硫酸新霉素的耐药率为55.6%，嗜水气单胞菌的耐药率为25.0%，杀鲑气单胞菌为0%，加权平均MIC值也有较大差异。另外，同种菌的不同菌株之间对抗菌药物的感受性也不一样，例如温和气单胞菌对乳酸诺氟沙星的感受性，有些MIC为8g/mL，有些为0.5g/mL，有些则≤0.25g/mL。

表4.不同病原菌种类的加权平均MIC值和耐药率

4.病原菌随使用抗菌药物的感受性变化

将顺通养殖场不同日期分离的虹鳟鱼病原菌的MIC值进行加权平均，形成病原菌加权平均MIC值随时间的变化图（见图1）。显然，病原菌的加权MIC值随药物的使用呈现上升趋势，而随药物的停用逐渐下降。说明药物使用与病原菌的加权平均MIC值呈正相关性。其中氟苯尼考在使用过程中，更易使病原菌短时间产生较高的MIC值。

图1.顺通养殖场虹鳟鱼病原菌加权平均MIC值随时间的变化图

三、讨论

本文从北京市两家虹鳟鱼养殖场的发病鱼体上共分离出25株疑致病性气单胞菌，其对磺胺类药物呈现较高的耐受性，耐药率均在84%以上。研究表明：病原菌体外耐药体内一定耐药。因此，这两家养殖场现阶段暂不能使用该类药物用于虹鳟鱼的疾病防治。

氟苯尼考是我国1999年批准的一种新型的动物专用的氯霉素类广谱抗生素，曾广泛应用于养殖生产。近年的室内研究报道，氟苯尼考容易使病原菌短时间产生较高的耐药性，并且耐药性消失较慢。本文从养殖场获取的数据验证了这一结论。同时，抗菌药物的使用与气单胞菌的MIC值呈正相关，即使按标准剂量使用抗菌药物也会使气单胞菌的耐药浓度数倍增加。并且，使用嗯诺沙星会使气单胞菌对同类药物的耐药性增加。

本文检测的虹鳟鱼源气单胞菌对盐酸多西环素和氟喹诺酮类药物较为敏感，耐药率均低于10%。其中盐酸多西环素为最敏感的药物，敏感率为100%。由于不同养殖场、不同病原菌种类、甚至同种病原菌的不同菌株对抗菌药物的感受性不同，因此在实际生产中针对某一渔场样品，需要针对具体样品及时检测，依据检测结果指导养殖者合理使用抗菌药物，才可能取得较好的效果。本文的结果，可以用于养殖场无法送样时，可参考使用文中的敏感药物及剂量。

本文采用的两种氟喹诺酮类药物乳酸诺氟沙星和烟酸诺氟沙星已经于2016年1月1日起禁止用于养殖生产，届时可采用该类药物中的嗯诺沙星。

采用药物控制细菌性疾病，只是鱼病诊治过程中的一个重要环节，在考虑到使用敏感药物种类及剂量情况下，还应同时关注养殖水环境以及鱼体免疫水平的改善。

作者单位：北京市水产技术推广站