2012—2015年某医院男性不育患者精液支原体阳性率和耐药情况动态分析

周运恒， 马红霞， 李 戬， 石晓星， 刘风华

·论著·

2012—2015年某医院男性不育患者精液支原体阳性率和耐药情况动态分析

周运恒1， 马红霞2， 李 戬1， 石晓星1， 刘风华1

目的 了解近4年来武警上海市总队医院男性不育患者精液中支原体检测阳性率和耐药情况，为临床抗菌药物的合理使用提供参考。方法 以4年来的3 278例男性不育患者和348例健康对照者为研究对象，采用固体-液体培养基联合检测对精液标本中的脲原体属和人型支原体进行培养、鉴定和药敏试验；采用SPSS 21.0软件进行比较分析。结果 近4年男性不育患者精液脲原体属和人型支原体的总阳性率为35 %～50 %，以脲原体属为主，其阳性率为31 %～40 %，均显著高于健康对照组（P＜0.05）；2012－2014年各种支原体阳性率变化不大；2015年总阳性率和脲原体属的阳性率高于前几年的阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05）；1 259例男性不育者支原体阳性的年龄主要集中在26～30岁和31～35岁年龄段，分别为37.8 %和32.1 %。在10种抗菌药物中，脲原体属对四环素类和大环内酯类抗菌药物的耐药率较低，均小于5 %，4年中对各种药物的耐药率变化不大。结论 该地区近4年来男性不育患者精液中支原体阳性率较高，且以脲原体属为主，多集中于26～30岁和31～35岁年龄段，与前3年相比，2015年阳性率明显升高，近4年来各种药物的耐药性变化不大，治疗上应首选四环素类和大环内酯类抗菌药物。

脲原体属； 人型支原体； 不育； 耐药性

近年来不育不孕发病率（15 %～20 %）逐渐上升，而且很多原因不明。大量研究表明，约15 %男性不育由泌尿生殖道病原体感染引起，而感染率最高的是脲原体属（以前称解脲脲原体属、解脲支原体或溶脲脲原体属，Ureaplasma spp.），其次是人型支原体（Mycoplasma hominis）、生殖支原体、衣原体、淋病奈瑟菌和病毒等［1-2］。这些病原体与男性不育之间的关系目前仍不甚清晰，而且很多致病机制不明确。文献对脲原体属和人型支原体在精液中的阳性率和耐药性的报道差异较大，可能与检测方法、受检人群和用药习惯等因素有关［3］。目前国内外对男性不育患者的研究较少，而且所分析标本多为尿道分泌物或前列腺液，而精液作为男性不育与支原体关系研究的首选标本，其覆盖面更广、漏诊率更低，更能反映患者的感染情况［4］。本研究采用液体-固体培养法对本地区近4年男性不育患者精液标本感染的脲原体属和人型支原体进行检测及药敏结果分析，探讨阳性率和耐药性变化情况，为临床诊治提供更为客观的依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象 以2012年1月－2015年12月在武警上海市总队医院就诊的3 278例男性不育患者为研究对象，年龄21～50岁，符合不育症诊断标准［5］。随机选择348例已经有生育或者妻子已经怀孕的健康男性作为对照组。

1.1.2 标本采集 禁欲3～7 d后手淫取精液于干燥消毒量杯内，立即送检，置37℃水浴箱内液化。

1.1.3 试剂 支原体选择性固体培养基和支原体分离、培养、鉴定、药敏试剂盒由众爱生河北生物科技有限公司提供，用OLYMPUS CR21显微镜观察。

1.2 方法

1.2.1 培养及体外药敏操作步骤 吸取液化后的精液100 μL分别接种在固体培养基和基础培养液中，用移液器分至商品化试剂盒的微孔板鉴定孔和药敏孔中，所有操作步骤均严格按照说明书进行，在37℃ 5 % CO2孵箱内培养48～72 h观察结果。10种抗菌药物分别是多西环素、米诺环素、交沙霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、左氧氟沙星、环丙沙星、司帕沙星和氧氟沙星。

1.2.2 结果判断 液体培养基判断标准：培养48 h，液体培养基由黄色变成红色和橙红色，且清亮为阳性，提示有支原体生长，凡≥104CFU（菌落形成单位）/mL鉴定孔试剂变色为支原体阳性的初筛对象，≤104CFU/mL为携带者或无致病意义。固体培养基阳性判断标准：培养48 h，用显微镜在低倍镜下观察支原体的菌落生长情况，以看到固体培养基上生长的支原体菌落作为阳性的确诊标准。脲原体属菌落较小，圆形棕褐色，多为海胆型；人型支原体菌落较大，无色、有宽大透明的周边带环绕的油煎蛋样。

药敏判断标准：通过颜色变化判断，每种药物均有高低2个浓度，药敏孔变红色为阳性，变黄色为阴性，两孔均阴性为敏感（S），前孔阳性，后孔阴性为中介（I），两孔均阳性为耐药（R）。

1.2.3 统计学处理 用SPSS 21.0软件进行统计分析，支原体阳性率和抗菌药物敏感率的比较采用Pearson卡方检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 支原体培养阳性率

近4年男性不育患者精液脲原体属和人型支原体的各年阳性率为35 %～50 %，均以脲原体属为主，其阳性率为31 %～40 %，人型支原体合并脲原体属的混合阳性率为0.9 %～9.1 %，人型支原体阳性率非常低，仅为0～2.1 %。不育组总阳性率和脲原体属的阳性率分别高于健康对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）。2012－2014年各种支原体阳性率变化不大，2015年总阳性率和脲原体属的阳性率高于前几年的阳性率，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

2.2 支原体阳性不育者年龄分布

共有1 259例男性不育者支原体培养阳性，占不育者的38.4 %。支原体阳性者年龄主要集中在26～30岁和31～35岁年龄段，分别为37.8 %和32.1 %，各年龄段的阳性率见表2。

表1 近4年不育患者精液支原体阳性率Table1 Prevalence of Mycoplasma in semen specimens of infertile males from 2012 to 2015

表2 1259例男性不育患者支原体阳性者年龄分布Table2 Isolation of Mycoplasma in 1 259 cases of infertile men in terms of age group

2.3 脲原体属对10种抗菌药物的耐药性

排除人型支原体单纯阳性和混合脲原体属阳性的研究对象，在1 138例脲原体属阳性患者中，脲原体属对米诺环素、多西环素、罗红霉素、阿奇霉素、交沙霉素和克拉霉素的耐药率均小于5 %；脲原体属对环丙沙星和氧氟沙星的耐药率较高，分别在60 %～70 %和36 %～56 %，而对左氧氟沙星和司帕沙星的耐药率较低，分别在3.4 %～16.5 %和4.8 %～11.3 %。近4年来各种药物的耐药率变化不大，无明显升高或降低的趋势，见表3。

表3 近4年男性不育患者检出脲原体属对10种抗菌药物的耐药率Table3 Antibiotic resistance of the Ureaplasma strains isolated from semen specimens of infertile males to ten antimicrobial agents from 2012 to 2015

3 讨论

支原体的检测主要有液体培养法、固体培养法、血清学方法和分子生物学方法。其中应用较多的是液体培养法，该法操作方便、简单，可以同时观察药敏结果，但是存在较多的假阳性和假阴性现象［6］。固体培养法可同时鉴别多种支原体混合感染，是检测支原体的金标准，但操作烦琐、成本较高［7-8］。既往文献显示男性不育患者生殖道感染率最高的是脲原体属，国外为5 %～58 %，健康生育组为3 %～31 %［9-10］，国内多为15%～20 %［11-14］。人型支原体在男性不育的致病作用和相关研究较少，但国外文献报道其阳性率可高达10.8 %～28 %［15-17］，脲原体属和人型支原体混合阳性率为7 %～22 %［18-19］。

本研究中，2012－2014年，男性不育患者脲原体属和支原体检测总阳性率均约35 %，无明显变化，但都显著高于对照组（18.9 %）。而2015年脲原体属、混合阳性和总阳性率均高于前3年，可能原因是研究对象的变化，以及固体培养法的应用提高了人型支原体及混合支原体的阳性率。而生育组接近20 %阳性率也说明健康人群也存在一定的隐性感染，支原体感染后大多症状轻微或无临床症状。临床上支原体感染的诊断需结合实验室检查、临床症状、感染途径等流行病学资料综合判断。最近在临床实践中发现，液体培养法对精液脲原体属和人型支原体存在较高的假阴性，不同的加样量和培养时间对液体培养法的结果影响也很大，而以往可能由于未仔细观察固体培养基而造成部分假阴性结果的漏报。但与国外报道相比，人型支原体和混合支原体的阳性率还很低，是方法学的原因还是检测人群流行病学的差异今后还需进一步的研究。

由于支原体的主要传播途径为性接触传播，其阳性率与年龄和性行为相关［20］。本研究中男性不育患者支原体阳性者主要集中在26～30岁和31～35岁年龄段，占总阳性率的70 %，与其他文献基本一致，说明生育高峰期和性活跃期的不育患者支原体阳性率也最高。

从本研究的药敏结果看，近4年来单纯脲原体属阳性者对2种半合成四环素类和4种大环内酯类抗菌药物的耐药率都非常低，均小于5 %，而对氧氟沙星和环丙沙星的耐药率较高，可能是由于本地区临床上对后者使用率较高所致，对前两者的耐药率明显低于喹诺酮类的左氧氟沙星和司帕沙星。半合成四环素类抗菌作用较强，半衰期长，口服吸收迅速，目前作为支原体治疗的首选药与其他文献报道基本一致［21］。本研究近4年来的耐药性与其他文献报道基本一致，但都低于女性，可能原因是女性抗菌药物用药比较频繁导致的耐药性增加，另外精液标本由于多种蛋白质缓存体系的存在是否会对脲原体属的耐药性有影响也值得讨论。支原体药敏试验最早在上世纪60年代提出，目前市场上的定性药敏商品化试剂盒多参考革兰阳性菌或梅里埃的标准，基本认为方法学可靠，但缺乏质控品和统一的标准，市场上也存在质量参差不齐的情况［22］。国内外仅有少数单位开展定量药敏检测，而且其质控标准在2012年底才确立，还需要其他国家和地区结合用药情况进一步完善［23-24］。所以，通过鉴定、分离、纯化和传代对感染的脲原体属进行定量药敏试验将会反映真正的耐药性。

支原体感染可能从多方面影响男性生育能力，如通过干扰精子发生、影响精子代谢、影响精卵结合及生殖道局部免疫等机制。因为存在隐性感染，所以在临床上关于支原体感染是否需要治疗也存在一定的争议，目前初步认为其致病性可能与生物群或血清型、感染时间和患者的免疫状态有关［25］。由于不育患者检测人群、支原体阳性率和抗菌药物耐药谱的差异，以及感染后症状的不典型性，临床上应加强支原体的动态监测和药敏试验，对于反复感染、经验性药物治疗效果不好的患者，最好进行脲原体属的定量药敏试验，个性化用药，精准治疗，有助于提高对患者泌尿生殖系残余支原体的清除和彻底治疗［26］。

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Changing prevalence and antibiotic resistance profile of Mycoplasma in semen from infertile males during the period from 2012 to 2015

ZHOU Yunheng， MA Hongxia， LI Jian， SHI Xiaoxing， LIU Fenghua.
（Department of Laboratory Medicine，Armed Police Corps Hospital of Shanghai， Shanghai 201103， China）

Objective This study was undertaken to investigate the prevalence and antibiotic resistance profle of Mycoplasma in semen samples from infertile males during the period from 2012 to 2015 in Shanghai. Methods A total of 3 278 infertile male patients and 348 healthy controls were recruited into the study from the infertility clinic from 2012 to 2015 in our hospital. Culture，identifcation and the antimicrobial susceptibility testing were done to characterize Ureaplasma and Mycoplasma hominis strains. SPSS 21.0 software was used to analyze the data. Results In 3 278 cases of infertile men， the prevalence of Mycoplasma was 35 %-50 % from 2012 to 2015. The prevalence of Ureaplasma strains was predominant from 31 % to 40 %， signifcantly higher than in healthy controls （P＜0.05）. The prevalence of total Mycoplasma and Ureaplasma in infertile males was signifcantly higher in 2015 than in other 4 years （P＜0.05）. The males of 26 to 30 and 31 to 35 years of age showed high risk of Mycoplasma infection in the 1 259 infertile males， evidenced by positive Mycoplasma in 37.8 % and 32.1 %， respectively. The Ureaplasma strains showed the lowest resistance rate to semisynthetic tetracyclines and macrolides （＜5 % resistant）. No obvious change about the resistant rateswas observed in the last 4 years. Conclusions The prevalence of Mycoplasma， especially Ureaplasma spp.， is high in the infertile males in Shanghai. The prevalence of Mycoplasma in 2015 was the highest in the last 4 years. The males of 26 to 30 and 31 to 35 years of age have high risk of Mycoplasma infections in the infertile males. Tetracyclines and macrolides are of choice for the potential Mycoplasma infection in theinfertile males in Shanghai.

Ureaplasma spp.； Mycoplasma hominis； infertility； antimicrobial susceptibility testing

R375

A

1009-7708 （ 2016） 05-0648-05

10.16718/j.1009-7708.2016.05.022

2015-12-21

2016-02-20

上海市自然科学基金（13ZR1449700）。

1. 武警上海市总队医院检验科，上海 201103；

2. 上海市东方医院体检中心。

周运恒（1976—），男，博士，副主任技师，主要从事临床微生物学及免疫学检验工作。

马红霞，E-mail：mahx2004@126.com。