高效液相色谱法测定竹叶提取物中的14种酚酸类化合物

王智聪　沙跃兵　余笑波

摘 要：该研究建立了原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等14种酚酸类化合物同时测定的高效液相色谱方法。色谱柱为Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm），采用甲醇-水（含0.1%甲酸）流动相体系，梯度洗脱，检测波长为274nm和324nm。结果显示，14种酚酸类化合物在0.250～50.0 μg/mL的范围内线性关系良好，相关系数r2均大于0.99；方法精密度良好，相对标准偏差（RSD）小于7.7%。表明该方法可用于竹叶提取物中酚酸类化合物含量的测定。

关键词：酚酸类化合物；竹叶提取物；高效液相色谱法

中图分类号 TS201.1 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）16-0109-05

Abstract：A simple method was developed in this paper for simultaneous determination of 14 phenolic acids by high pressure liquid chromatography，the compounds includes protocatechuic aicd，gentisic aicd，m-hydroxybenzoic aicd，chlorogenic acid，vanillic acid，caffic acid，syringic acid，p-coumaric acid，terulic acid，sinapic acid，homoorientin，orientin，vitexin and isovitexin. The samples were separated by Agilent ZORBAX SB-C18 column（5μm，4.6×250mm）using methanol and 0.1% formic acid aqueous solution as mobile phases by gradient elution under 274nm and 324nm for different compound.The results showed that there are good linear ranges with 0.250～50.0μg/mL，good correlation coefficients（r2）with greater than 0.99，and good precisions with less than 7.7% of relative standard deviations for all 14 phenolic acids.The method can be used for phenolic acids determination for bamboo extract samples.

Key words：Phenolic acids；Bamboo extract；High pressure liquid chromatography

竹叶提取物又称竹叶抗氧化物，是一种新型的植物提取制剂。竹叶抗氧化物作为天然抗氧化剂已被列入到我国《食品添加剂使用卫生标准》（GB2760）中，允许在食用油脂、肉制品、水产品、膨化食品、油炸食品、焙烤食品、即食谷物及果蔬汁饮料和茶饮料等几大类食品中使用。国家标准《食品添加剂竹叶抗氧化物》（GB30615）已在2014年11月1日起实施。

竹叶提取物具有优良的抗氧化、抗自由基、抗疲劳、抗病毒、抗菌、抗炎、降脂和增强免疫等作用[1-5]。龚金炎等[6]采用液相色谱法测定了竹叶抗氧化剂中绿原酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等8种酚酸类化合物的含量。基于竹叶提取物具有良好的抗氧化等药理功效，有必要对其活性成分进行系统的研究，尤其是酚酸类化合物在竹叶提取物中的存在形式及分布特征等进行系统的研究。但文献中鲜有竹叶中其他种类的酚酸类化合物测定的报道，本研究在上述8种酚酸类化合物的基础上，建立了竹叶提取物中14种酚酸类化合物含量测定的方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂 Aliance e2695高效液相色谱，配光电二极管阵列检测器和Empower 3数据处理系统（美国Waters公司）；AG285精密电子天平（瑞士Mettler Toledo公司）；5810R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司）；KQ-100DE数控超声仪（昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）。甲醇（色谱纯）购自德国Merck公司；甲酸（分析纯）购自美国Sigma-Aldrich公司；原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸和芥子酸标准品购自美国Sigma-Aldrich公司；荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷标准品购自上海同田生物技术有限公司；竹叶（金刚竹）采自当地；竹叶抗氧化剂（1#）样品购自浙江圣氏生物科技有限公司；竹叶抗氧化剂（2#）样品由浙江大学张英课题组提供。

1.2 实验方法

1.2.1 标准工作溶液的配制 分别称取适量原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、绿原酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸、阿魏酸、芥子酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷标准品，加适量甲醇漩涡震荡、超声溶解，配制浓度均为2.00mg/mL的母液；再用超纯水序列稀释，配制浓度分别为0.250、0.350、0.500、0.750、1.00、2.50、5.00、10.0、25.0、50.0μg/mL的混合标准工作溶液。

1.2.2 竹叶样品的提取 采摘新鲜竹叶适量，用自来水清洗泥污，再用超纯水冲洗数次，沥干，置于40℃烘箱干燥过夜；取出分拣，丢弃干枯枝叶，去枝除梗；将干燥竹叶置于粉碎机打碎，干燥保存备用。称取适量干燥粉碎后的竹叶样品，按照1∶20的料液比，加入60%的甲醇溶液，超声提取30min，取出于4 000r离心10min，倒出上清液；残渣再按照上述方法提取1次；合并上清液，混匀，用超纯水稀释2倍后进行测定。

1.2.3 竹叶抗氧化剂样品的配制 称取适量竹叶抗氧化剂样品，加入适量甲醇，配制浓度为10mg/mL的溶液；并于4 000r离心10min，吸出上清液，用超纯水稀释4倍后进行测定。

1.2.4 色谱分析条件 色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（5μm，4.6×250mm）；柱温：35℃；流速：1.0mL/min；流动相A：含0.1%甲酸的水溶液；流动相B：甲醇；梯度洗脱：5%B（1min）～12%B（3min）～15%B（13min）～19%B（15min）～21%B（25min）～26%B（26min）～29%B（32min）～30%B（45min）～45%B（55min）～98%B（56min）～98%B（60min）～5%B（61min）～5%B（65min）；紫外检测波长：274/324nm；进样体积：10μL。

2 结果与分析

2.1 样品前处理方法的优化 植物提取物成分复杂，既有极性较大的糖类、氨基酸类和酚酸类等，又有极性较小的黄酮类和叶绿素等化合物，为了有效地进行组分的分离，应当选择较长的色谱柱[7-11]，实验中采用柱长为250mm的色谱柱，各组分得到了较好的分离。在流动相中添加酸性添加剂，可以调节酚酸类化合物的解离，添加0.1%的甲酸有效地抑制了酸性化合物的解离，从而提酚酸类高化合物在反相色谱的保留能力，色谱峰型也较好。14种酚酸类化合物中以羟基苯甲酸为母核的酚酸类化合物在250～290nm有最大吸收，而以羟基肉桂酸为母核的酚酸类化合物及绿原酸、碳苷黄酮等在310～330nm有最大吸收。因此，对原儿茶酸、对羟基苯甲酸、香草酸和丁香酸采用274nm的波长进行定量分析，而对其他化合物则采用324nm的波长进行定量分析。14种酚酸类化合物在274nm和324nm的色谱如图1所示。

1.原儿茶酸；2.龙胆酸；3.对羟基苯甲酸；4.绿原酸；5.香草酸；6.咖啡酸；7.丁香酸；8.香豆酸；9.阿魏酸；10.芥子酸；11.异荭草苷；12.荭草苷；13.牡荆苷；14.异牡荆苷

2.2 竹叶样品提取条件的优化

2.2.1 料液比的优化 称取干燥粉碎后的竹叶样品1g（精确至0.001g）5份，按照1∶10、1∶20、1∶30、1∶40和1∶50的料液比，分别加入10mL、20mL、30mL、40mL和50mL的75%甲醇-水溶液（体积比），超声提取30min；取出于4 000r离心10min，上清液用超纯水稀释2倍后，进行液相色谱分析。以绿原酸为例，在不同料液比的情况下，其含量变化如图2所示。从图2可以看出，绿原酸的含量随料液比的增加先减少后增大，但总体变化不大。总体来看，增大料液比，提取效率有所增加，但提取液中绿原酸的浓度变低。考虑到竹叶提取物中酚酸类化合物的含量较低，提取液浓度太低，不利于其中酚酸类化合物的测定；但是减少料液比，如采用1∶10的料液比，虽然提取物中酚酸类化合物的浓度增加，但是较小的料液比不利于酚酸类化合物的浸出。因此，综合考虑，实验中采用1∶20的料液比。

2.2.2 提取溶剂的优化 称取干燥粉碎后的竹叶样品1g（精确至0.001g）6份，按照1∶20的料液比，分别加入20mL 50%、55%、60%、70%、80%和90%的甲醇-水溶液（体积比），超声提取30min；取出于4 000r离心10min，上清液用超纯水稀释2倍后，进行液相色谱分析。以绿原酸为例，在不同提取溶剂的情况下，绿原酸提取含量的变化如图3所示。从图3可以看出，绿原酸的含量随提取溶剂中甲醇含量的增加先增大后减少，在60%甲醇含量的情况下，绿原酸的提取含量最大。增加提取溶剂中甲醇的含量，有利于竹叶中绿原酸的浸出；但提取溶剂中甲醇含量太高，绿原酸的含量反而降低，其原因可能是酚酸类化合物的极性较大，提取溶剂中水的比例减少，反而不利于其浸出。另外，增加甲醇的含量，竹叶中其他非极性杂质如叶绿素等的浸出量也增加，不利于后续的分析。因此，实验中采用甲醇含量为60%的提取溶剂。

2.2.3 提取时间的优化 称取干燥粉碎后的竹叶样品1g（精确至0.001g）6份，按照1∶20的料液比，加入20mL 75%的甲醇-水溶液，分别超声5、10、20、30、45、60min；取出于4 000r离心10min，上清液用超纯水稀释2倍后，进行液相色谱分析。以绿原酸为例，其含量变化如图4所示。从图4可以看出，绿原酸的含量随超声时间的增加而增加，60min时最大，可能是由于随着超声时间的增加，超声水浴温度升高，导致60min时绿原酸的含量变化较大；但在45min前，绿原酸的含量缓慢增加。为了节省时间，以及由于后续需要多次提取的缘故，实验中选择超声30min。

2.2.4 提取次数的优 称取干燥粉碎后的竹叶样品1g（精确至0.001g），按照1∶20的料液比，加入20mL 75%的甲醇-水溶液，超声提取30min，取出于4 000r离心10min，倒出上清液；残渣再加入20mL 75%的甲醇-水溶液提取3次。对每次提取离心后的上清液，用超纯水稀释2倍后进行液相色谱分析。以绿原酸为例，其含量变化如图5所示。从图5可以看出，绿原酸的含量随提取次数的增加而增加，提取2次后，提取回收率大于95%，实验中选择提取2次。

2.3 线性关系、线性范围和检出限 对1.2.1节配制的混合标准工作溶液，按照1.2.4节的色谱方法进行分析，以标准品的浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，进行线性回归。以标注曲线的最低点为最低定量浓度，以3倍信噪比（S/N）计算检出限。各化合物的回归方程、线性范围、相关系数及检出限如表1所示，结果表明各酚酸类化合物在给定浓度范围内线性关系良好。

2.4 方法精密度 按照1.2.2节的方法，称取5份竹叶样品，独立进行提取和分析，以绿原酸为指标，考察提取方法的精密度，测定结果的相对标准偏差（RSD）小于7.7%；对1.2.3节制备的竹叶抗氧化剂样品，进行5次重复进样，考察分析方法的精密度，对各酚酸类化合物，测定结果的相对标准偏差（RSD）均小于3.2%。

2.5 样品的测定 对1.2.2和1.2.3节制备的竹叶提取物和竹叶抗氧化剂样品，每个样品重复制备3次，按照1.2.4节的色谱方法进行分析，以竹叶抗氧化剂2#样品为例，其色谱如图6所示。

其中C表示竹叶干燥样品或竹叶抗氧化剂产品中酚酸类化合物的含量（g/kg），C'表示由标准曲线读出的含量（μg/mL），V表示样品提取或溶解的总体积（mL），D表示进样前的稀释倍数，m表示样品的称取质量（g）。

竹叶（干燥品）及竹叶抗氧化剂中各酚酸类化合物的含量测定结果如表2所示。从表2可以看出，竹叶提取物中各种酚酸类化合物的含量差异较大。竹叶中酚酸类化合物的含量较低，主要含有荭草苷、异荭草苷、龙胆酸和绿原酸等，而竹叶抗氧化剂产品中酚酸类化合物的含量较高。竹叶抗氧化剂1#产品中酚酸类化合物的总量占产品总质量的54.0%，2#产品占36.3%；其中4种竹叶黄酮在竹叶抗氧化剂1#和2#产品中占酚酸类化合物的总量90.9%、61.8%；竹叶黄酮中主要以荭草苷和异荭草苷存在，在两种竹叶抗氧化剂中均占竹叶黄酮总量的80%。

对以羟基苯甲酸为母核和以羟基肉桂酸为母核的酚酸类化合物，在两种竹叶抗氧化剂中主要以龙胆酸、绿原酸、阿魏酸和芥子酸为主，并且与竹叶黄酮的分布存在明显的差异。龚金炎等[6]指出，对大孔树脂法制备的竹叶抗氧化剂产品，在大孔树脂洗脱过程中会损失极性较大的酚酸类化合物。本研究的竹叶抗氧化剂1#产品即为大孔树脂法精制而得，而竹叶抗氧化剂2#产品为正丁醇液-液萃取法精制而得，表现出1#产品中竹叶黄酮的含量高于2#产品；相反，其他酚酸类化合物在2#产品中的含量高于1#产品，如图7所示。除制备工艺外，竹叶原料的差异也会影响竹叶提取物中酚酸类化合物的分布。

文献中常见对竹叶提取物中绿原酸、咖啡酸、香豆酸、阿魏酸、荭草苷、异荭草苷、牡荆苷和异牡荆苷等化合物进行分析，未见其他如以苯甲酸为母核和肉桂酸为母核的酚酸类化合物测定的报道。本研究除上述8种酚酸类化合物以外，还测定了原儿茶酸、龙胆酸、对羟基苯甲酸、香草酸、丁香酸和芥子酸等，并探讨了酚酸类化合物在不同工艺制备的竹叶抗氧化剂产品中的分布，对全面了解竹叶提取物中的酚酸类化合物提供新的思路。

3 结论

本研究建立了竹叶提取物中14种酚酸类化合物的测定方法，通过色谱分离条件的优化，各组分与杂质取得了良好的分离度，该方法线性关系良好、检出限低、精密度高。该方法用于竹叶提取物中酚酸类化合物含量的测定，结果显示竹叶及不同工艺制备的竹叶抗氧化剂产品中酚酸类化合物的分布特征差异显著。所建立的方法对竹叶抗氧化剂产品的原料选择、质量控制、制备工艺优化及其基础营养、保健和药理研究等具有非常重要的意义。

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（责编：张宏民）