吡柔比星脂质体制备与表征及其体外抗肿瘤作用

王学菊　程少会　高立明　郑　磊　邸　娅　付占昭　姜　丽　徐红梅　王丽萍

(吉林大学中日联谊医院病理科，吉林　长春　130033)



吡柔比星脂质体制备与表征及其体外抗肿瘤作用

王学菊程少会1高立明1郑磊1邸娅1付占昭1姜丽1徐红梅1王丽萍

(吉林大学中日联谊医院病理科，吉林长春130033)

目的构建吡柔比星脂质体，提高吡柔比星的生物利用度和抑瘤作用，降低其毒副作用。方法采用薄膜水化法制备吡柔比星脂质体，并测定其包封率和物理性状。构建乳腺癌细胞U14的荷瘤裸鼠模型，分别尾静脉注射吡柔比星裸药及吡柔比星脂质体，分析其抑瘤作用。结果薄膜水化法制备的吡柔比星脂质体平均粒径(140.9±2.36)nm，多分散系数为(0.203±0.01)，Zeta电位为-(14.2±2.64)mV，包封率为(75.1±3.5)%，并且可以缓释吡柔比星；吡柔比星脂质体组抑瘤率(75.1±8.6)%高于吡柔比星裸药组(64.9±12.2)%。结论吡柔比星脂质体是很有潜力的抗肿瘤纳米药物。

吡柔比星;脂质体;包封率；薄膜水化法；抑瘤率

脂质体作为药物载体，具有靶向性、降低药物毒性、减少药物剂量等优点，因此脂质体作为药物载体被重视并得到了广泛应用〔1～3〕。脂质体作为抗癌药物载体能增加与癌细胞的亲和力，且能够增加药物被癌细胞的摄取量，克服耐药性，降低用药量，提高疗效，降低毒副作用。由于脂质体的功能不同，脂质体可分为传统脂质体、隐身脂质体、长循环脂质体，免疫脂质体等〔4〕。目前制备脂质体常规的方法有薄膜分散法、逆向蒸发法、表面活性剂除去法、乙醇注入法、乳化法以及pH梯度法、硫酸铵梯度法等〔5〕。吡柔比星主要用于治疗的恶性肿瘤包括白血病、乳腺癌、子宫癌、卵巢癌和肺癌等〔6〕。吡柔比星为红色无臭粉末，其油水分配系数Log P为4.102(参考值)，脂溶性好，能溶于乙醇和甲醇等溶剂，但其有累积性心脏毒性〔7〕、骨髓抑制、严重胃肠道反应毒副作用〔8〕。本文采用薄膜水化法制备吡柔比星脂质体，降低吡柔比星的毒副作用并提高通过其生物利用度，测定吡柔比星脂质体的粒径、多分散系数、Zeta电位、包封率、释放曲线，构建乳腺癌细胞U14的荷瘤裸鼠模型，研究吡柔比星脂质体对实体瘤的肿瘤抑制率。

1　材料与方法

1.1材料及仪器吡柔比星(Sigma-Aldrich试剂公司)，大豆卵磷脂、胆固醇(上海艾韦特医药科技有限公司)，二氯甲烷、甲醇(天津市风船化学试剂科技有限公司)。

恒温水浴锅(杭州迅数科技有限公司)、旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器有限公司)、透射电镜(JEOL JEM-1230)、超声波清洗仪(日本岛津)、紫外-可见吸收光谱仪(Agilent 8453)、马尔文粒度分析仪(ZEN3600，Malvern Instruments Ltd，UK)。昆明小鼠50只，SPF级，均为雌性，体重(18±2)g。U14宫颈癌细胞株(北京联合利华生物技术有限公司)。

1.2吡柔比星脂质体的制备将一定量的大豆卵磷脂、吡柔比星和胆固醇溶于6 ml的甲醇-氯仿溶液中(氯仿与甲醇的体积比为2∶1)。在40℃，抽真空下除去有机溶剂，通氮气5 min以除去残留的有机溶剂.将10 ml磷酸缓冲液(pH7.4)加入茄型瓶中水化15 min，超声15 min，经0.45 μm和0.22 μm滤膜过滤制得吡柔比星脂质体。

1.3吡柔比星脂质体的形态通过透射电子显微镜观察脂质体形貌。将一滴脂质体滴加到铜网上，2 min后使用滤纸将铜网表面液体小心吸走。待铜网风干后使用2%的钼酸铵对其进行负染并在风干后在透射电镜下观察。

1.4吡柔比星脂质体粒径测定、多分散系数和Zeta电位测定取脂质体少量，适量蒸馏水稀释后，激光粒度分析仪测定吡柔比星脂质体的平均粒径及粒度分布、多分散系数和Zeta电位。

1.5吡柔比星脂质体包封率的测定采用超滤离心法测定吡柔比星脂质体的包封率。取吡柔比星脂质体2 ml，4 000 r/min离心30 min，收集下清液，紫外分光光度计分析下清液中吡柔比星含量(M游离)。脂质体溶液中吡柔比星总质量M总计算包封率：EE=(M总-M游离)/M总×100%。

1.6吡柔比星脂质体释放曲线的测定取2 ml吡柔比星脂质体置入透析袋中，放入50 ml一次性离心管中；加入释放介质(PBS，pH7.4)30 ml，于37℃、110 r/min恒温振荡。分别于0.25、0.5、1、2、4、6、8、16、24和40 h取样2 ml(同时补充等温等量释放介质)，用紫外分光光度计于495 nm测定波长处测定吡柔比星的含量。

1.7荷宫颈癌U14小鼠模型的建立昆明小鼠饲养环境为室温18℃～25℃，空气湿度40%～60%，昼夜节律。垫料、笼具、饮水等高压蒸汽灭菌处理，小鼠饲料为SPF级专用高压灭菌饲料，更换垫料和笼具等操作在超净工作台内进行。用生理盐水稀释U14宫颈癌细胞株到适宜的浓度(1×107个/ml)，在每只小鼠的左前肢腋下注射，0.2 ml/只。

1.8小鼠分组将小鼠随机分为5组，每组10只：①空白对照组：正常饲养，不予尾部静脉注射；②阴性对照组：给药14 d，隔天通过尾部静脉的方法给予0.25 ml生理盐水给药；③阳性对照组：给药14 d，隔天通过尾部静脉的方法给予0.25 ml环磷酰胺溶液给药；④吡柔比星脂质体组：给药14 d，隔天通过尾部静脉的方法给予0.25 ml吡柔比星脂质体溶液给药；⑤吡柔比星裸药组：给药14 d，隔天通过尾部静脉的方法给予0.25 ml吡柔比星裸药溶液给药。

1.9抑瘤率测定第14天处死小鼠后，取肿瘤组织，称取其质量，计算抑瘤率：抑瘤率=(1-给药组瘤质量/阴性对照组平均瘤质量)×100%。

2　结　果

2.1吡柔比星脂质体的形貌吡柔比星脂质体呈现一定的球状形貌，视野内脂质体分布均匀，粒径均一且圆整，粒径约为140 nm。见图1。

图1　吡柔比星脂质体(TEM)

2.2吡柔比星脂质体的粒径吡柔比星脂质体的平均粒径为(140.9±2.36)nm，与透射电镜下观察的粒径一致，其多分散系数为0.203±0.01。吡柔比星脂质体的粒径分布呈正态分布，多分散系数表明粒径分布比较集中，且达到了纳米药物的要求。因为肿瘤细胞生长速度快，细胞间距大致在100～200 nm，而正常组织间距在50 nm左右。纳米药物最适宜的粒径应该在100～200 nm，这样药物更容易进入肿瘤组织而不易进入正常的组织间，从而发挥作用。

2.3吡柔比星脂质体的Zeta电位吡柔比星脂质体的Zeta电位在(-14.2±2.64)mV，表明脂质体具有一定的稳定性，可以长时间保存而不发生聚沉现象。

2.4吡柔比星脂质体的包封率用紫外分光光度计测在495 nm波长处测定吡柔比星浓度分别为5、10、15、20、30和40 μg/ml溶液的吸光度，吡柔比星的标准曲线为y=0.015 8x+0.061 4，R2=0.998 8。通过包封率计算公式可以计算得包封率为(75.1±3.5)%。

2.5吡柔比星释放曲线如图2所示，吡柔比星裸药快速释放且在第4小时处完全释放，而吡柔比星脂质体前期释放速度较快且逐渐变缓，吡柔比星脂质体相比于吡柔比星裸药具有一定的缓释性。吡柔比星脂质体可以缓释吡柔比星，从而延长其在体内的保留时间，提高其药效。

图2　吡柔比星裸药与吡柔比星脂质体释放曲线

2.6吡柔比星脂质体对U14荷瘤小鼠肿瘤抑制作用吡柔比星脂质体的抑瘤率可以达到(75.1±8.6)%，而吡柔比星裸药的抑瘤率为(64.9±12.2)%，说明吡柔比星可以抑制肿瘤的生长，而吡柔比星脂质体对肿瘤具有更好的抑制作用。吡柔比星脂质体可以提高吡柔比星的水溶性，其磷脂层可以介导药物通过细胞膜。此外，吡柔比星脂质体的增加滞留和渗透(EPR)效应可以使药物的被动靶向到肿瘤组织。并且，吡柔比星脂质体可以缓释药物，从而提高药物的生物利用度。

3　讨　论

本文以薄膜水化法制备吡柔比星脂质体，薄膜水化法适用于脂溶性药物脂质体的制备，制备出的吡柔比星脂质体呈红色混悬体系。透射电镜下观察吡柔比星脂质体的形貌，吡柔比星脂质体圆整且粒径均一，并且分散均匀，与粒径的分散系数测定结果一致。吡柔比星脂质体电位为-10.8 mV，可以是脂质体保持稳定，不产生絮凝。吡柔比星脂质体可以缓释吡柔比星，延长其在体内时间。吡柔比星脂质体的粒径可以使其通过EPR效应进入肿瘤组织。体外实验吡柔比星脂质体组抑瘤率高于吡柔比星裸药组，证明了吡柔比星脂质体是很有潜力的抗肿瘤药物。

1Luo LM，Huang Y，Zhao BX，etal.Anti-tumor and anti-an-angiogenic effect of metronomic cyclic NGR-raodified liposomes containing paclitaxe〔J〕.Erials，2013；34(4)：1102-14.

2Alhariri M，Azghani A，Omri A.Liposomal antibiotics for the treatment of infectious diseases〔J〕.Exp Opin Drug Del，2013；10(11)：1515-32.

3Sun HY，Cacciarelli TV，Singh N.Micafungin versus amphotericin B lipid complex for the prevention of invasive fungal infections in high-risk liver transplant recipients〔J〕.Transplantation，2013；96(6)：573-8.

4Yogita PP，Sameer J.Novel methods for liposome preparation〔J〕.Chem Phys Lipids，2014；177：8-18.

5王瑞莲，刘成梅，刘伟.脂质体制备方法的研究进展〔J〕.农产品加工学刊，2007；109(7)：8-14.

6Fujiwara A，Hoshino T，Westley JW.Anthracycline antibiotics〔J〕.Crit Rev Biotechnol,1985；3(2)：133.

7吕俊，丁念，朱家蔷，等.蕙环类药物心脏毒性及其预防的研究进展〔J〕.中国医院药学杂志，2008；28(15)：1302-6.

8贾彦熹，贾英杰，赵成，等.吡柔比星联合化疗治疗晚期肿瘤37例临床观察〔J〕.肿瘤研究与临床，2005；17(1)：59-60.

〔2016-07-14修回〕

(编辑曲莉)

吉林大学横向课题(2014220101000363)

王丽萍(1963-)，女，主任医师，硕士生导师，主要从事肿瘤病理学研究。

王学菊(1978-)，女，主治医师，主要从事生物化学与分子生物学研究。

R73

A

1005-9202(2016)17-4174-02；doi：10.3969/j.issn.1005-9202.2016.17.017

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