rd29A和CaMV-35S启动子调控转AtDREB2A苜蓿耐碱性分析

才华，宋婷婷，张大洋

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨　150030）

rd29A和CaMV-35S启动子调控转AtDREB2A苜蓿耐碱性分析

才华，宋婷婷，张大洋

（东北农业大学生命科学学院，哈尔滨150030）

rd29A和CaMV-35S启动子广泛应用于植物基因工程中，但调控效果在不同转基因植物中不同。文章采用Real-time PCR分析转基因各株系中AtDREB2A基因表达差异；对苜蓿扦插苗及一年生转基因苜蓿成苗分别作50 mmol·L-1NaHCO3（pH 8.0）和混合盐碱土（pH 9.3）处理，统计苜蓿各株系成活率、开花植株数，测定叶绿素、丙二醛、相对电导率及根系活力。结果表明，两种启动子对AtDREB2A表达的调控存在明显差异，35S启动子调控的AtDREB2A为超量表达，碱胁迫处理后显著上调，达57.6倍；rd29A启动子调控AtDREB2A诱导表达，表达量低于35S启动子调控株系（20.7倍），AtDREB2A超量表达抑制植株正常生长。在幼苗期和成苗期，两种启动子各转基因株系均有一定耐碱能力，但存在差异。AtDREB2A诱导表达耐碱性效果更明显，其叶绿素含量、相对电导率、MDA、根系活力变化均显著低于AtDREB2A超量表达。研究两种启动子调控的转AtDREB2A基因苜蓿耐碱效果，为AtDREB2A基因在苜蓿耐碱基因工程中应用提供方法。

苜蓿；AtDREB2A；rd29A启动子；耐碱性；转基因

才华，宋婷婷，张大洋.rd29A和CaMV-35S启动子调控转AtDREB2A苜蓿耐碱性分析［J］.东北农业大学学报，2016，47（9）：16-23.

Cai Hua，Song Tingting，Zhang Dayang.Alkaline tolerance analysis of transgenic alfalfa withAtDREB2Agene regulated by rd29A or（CaMV）35S promoter［J］.Journal of Northeast Agricultural University，2016，47（9）：16-23.（in Chinese with English abstract）

黑龙江省是苜蓿主产区和重要的畜牧业基地。然而，黑龙江省盐碱土占总面积的11.99%，主要分布在大庆地区，严重制约苜蓿种植面积扩大，影响畜牧业长足发展［1］。如能在该地区培育出耐盐碱转基因苜蓿，可满足苜蓿干草数量和质量需求，减少优质苜蓿进口量，促进畜牧业发展。

近年来，随着分子生物学和苜蓿转基因技术成熟［2-4］，为苜蓿耐盐碱分子育种研究提供重要手段。Tang等通过在苜蓿中过量表达WRKY20转录因子基因，发现转基因苜蓿对干旱、高盐抵御能力增强［5］。Bao等将拟南芥的液泡氢离子焦磷酸酶基因转入苜蓿中，发现转基因苜蓿对干旱和盐分胁迫抗性增加［6］。

DREB（Dehydration responsive element binding protein）转录因子是目前非生物胁迫分子生物学研究热点。以多种植物为材料，在基因分离［7］、结构分析［8-9］、功能鉴定［10-12］等方面开展大量研究，结果表明，DREB转录因子在植物对非生物胁迫反应中具有调控作用［13-15］，在牧草非生物胁迫基因工程应用研究中起重要作用［16-18］。

启动子是调控基因表达的关键元件，尽管CaMV-35S启动子是基因工程中使用最多的启动子，但其非特异性表达不仅造成植物能量过度消耗，还可能诱发外源基因沉默，影响转基因植株正常生长发育。拟南芥rd29A启动子是一个受干旱、低温、盐诱导表达的启动子，含有干旱、高盐、低温、ABA诱导表达等相关的顺式作用元件（TACCGACAT）［19-20］，利用胁迫诱导启动子rd29A代替组成型强启动子，不仅增强植株胁迫耐受力且对其生长的负面影响最小，因此，已广泛应用于抗逆基因工程［21］。文益东等研究发现，AtDREB2A的超量表达提高苜蓿幼苗耐碱能力，但持续碱胁迫，转基因苜蓿耐碱性并不理想［18］。本研究通过分析由不同启动子rd29A、CaMV-35S调控的AtDREB2A转基因苜蓿耐碱性，获得应用价值较高的耐碱性转基因苜蓿，为AtDREB2A在苜蓿耐碱基因工程中的应用提供有效方法。

1　材料与方法

1.1材料

rd29A和35S启动子调控的转AtDREB2A苜蓿株系To代植株由前期研究获得［22］，转基因植株所用植物表达载体骨架为pBI121，筛选标记基因为npt-II，启动子为CaMV-35S。转基因To代5次扩繁株系名称分别为rd29A-DREB2A（rd-D-1/rd-D-2/rd-D-3）、35S-DREB2A（35S-D-1/35S-D-2/35SD-3）。阴性对照品种为肇东紫花苜蓿，由东北农业大学崔国文教授提供。

1.2转基因各株系AtDREB2A的Real-time PCR分析

采用Real-time PCR对扩繁后PCR显示阳性植株作外源基因表达量分析。以6个转基因株系（rd-D-1/rd-D-2/rd-D-3、35S-D-1/35S-D-2/35S-D-3）及对照扦插苗叶片为检测材料，每个株系检测3株扦插苗。参照RNAprep pure Plant Kit说明书提取植物总RNA。参照SMART cDNA synthesis Kit说明书合成cDNA第一链。使用TaKaRa SYBR®Premix Ex Taq™Ⅱ（RNaseH Plus）试剂并参照其说明书进行Real-time PCR检测。以苜蓿β-actin（GenBank：BT051890.1）为内参，引物为P1：5'GGAAACATC⁃GTATTGAGTGGTGGTA 3'；R1：5'AAGGTGCTGA GGGAAGCCAAA 3'。AtDREB2A特异引物序列为：DR-P3：5'CAACAGCAGGATTCGCTATCTG 3'；DR-R3：5'ACATCGT CGCCATTTAGGTCA 3'。

1.3转基因苜蓿扩繁

苜蓿为多年生草本植物，营养生长周期长，难以在短期内获得用于耐碱性分析种子。为此，本文对转基因苜蓿6个株系和对照植株作扦插扩繁。选取生长状态良好苜蓿植株，剪取木质化程度较高的均匀一致枝条浸泡于1 mg·L-1IBA 30 s后，插入装有沙土营养钵中，温室培养约30 d后（1 000 lx光照，14 h/10 h光照/黑暗周期，27℃/ 18℃昼夜温度），对扩繁苜蓿幼苗作耐盐碱性分析试验，统计扩繁植株成活率和生根率。扩繁培育在温室内完成。

1.4转基因苜蓿耐碱性分析

1.4.1转基因苜蓿幼苗期耐碱处理条件

由于3个转rd29A-DREB株系和3个转35SDREB株系中DREB表达量相似，将6个株系扦插苗分为两个群体，作耐碱性差异分析。

扩繁植株成活8周时，选取长势均匀苜蓿幼苗移栽到装有细砂的营养钵（口径为9 cm，高为8 cm）中定植，定植后每3 d用Hoagland营养液透灌1次。并用50 mmol·L-1NaHCO3（pH 8.0）胁迫液每日50 mL透灌营养钵，处理14 d。幼苗期碱胁迫及生理指标测定在温室内完成。

1.4.2转基因苜蓿成苗期碱处理条件

选取长势均匀1年龄成苗苜蓿。分别定植于正常土壤：盐碱土=16∶1的混合盐碱土（pH 9.3）中。以100 mol·L-1（pH 9.3）Na2CO3∶NaHCO3=1∶2为胁迫液每周浇灌1次，12周后测得混合盐碱土pH为9.3，灌水深度为15 cm。胁迫处理80 d后统计成活率，并取材测定生理指标；胁迫处理一直持续到开花期，调查可正常开花株系数。室外测定成苗期碱胁迫及生理指标。

1.4.3耐盐碱转基因苜蓿生理指标测定

分别测定存活的耐碱转基因苜蓿幼苗及成苗叶绿素、丙二醛含量、相对电导率及根系活力等生理指标［3］。每个群体测定15株扦插苗，重复3次。使用Excel 2007统计分析。

2　结果与分析

2.1转基因各株系AtDREB2A表达量分析

为比较启动子调控目的基因效果，对6个转基因株系（rd-D-1/rd-D-2/rd-D-3、35S-D-1/35S-D-2/35S-D-3）PCR阳性扦插苗Real-time PCR检测（见图1）。转AtDREB2A株系外源基因均能表达，但由于启动子不同，基因表达量存在较大差异。未经胁迫诱导，35S启动子调控的AtDREB2A为超表达，表达量为未转基因对照的38倍；而rd29A启动子调控的AtDREB2A表达与未转基因对照表达量无明显差异，仅为2.6倍。经盐胁迫处理1 h后，35S启动子调控的AtDREB2A表达量有所提高，而rd29A启动子调控的AtDREB2A表达量明显增加，但低于35S启动子调控表达量（仅是未处理的20.7倍，而35S株系则是57.6倍）。由此表明，rd29A和CaMV-35S启动子对AtDREB2A表达调控存在明显差异。

2.2不同启动子转基因苜蓿耐碱性差异分析

选取PCR阳性植株，剪取木质化程度较高枝条扩繁，两个株系扩繁植株生根率和成活率存在差异（结果略）。rd29A启动子调控的转基因苜蓿长势明显好于35S，主要表现在生根较快，地上部分生长迅速，成活率较高。推测CaMV-35S调控的外源基因持续超量表达抑制植株生长，与Chen等在大豆中研究结果相同［23］。转录因子在组成型强启动子驱动下异源超表达，即使在正常生长条件下，也会启动基因表达。这种错误基因表达常造成转基因植株在正常生长条件下株型变异和植株矮小［24］。

2.2.1幼苗期转基因苜蓿耐碱性分析

为比较不同启动子调控的转基因苜蓿耐碱性差异，选取扩繁成活，长势基本一致材料轻度pH碱胁迫处理。50 mmol·L-1NaHCO3（pH 8.0）处理14 d后，非转基因苜蓿出现叶片部分发黄、枯萎现象，rd-DREB2A和35S-DREB2A转基因株系叶片仍为绿色，生长状态正常（见图2），两者表型无明显差异。

图1　转基因苜蓿各株系NaHCO3胁迫处理前后AtDREB2A表达变化Fig.1Change of AtDREB2A genes expression in wild type（WT），35S-D，rd-D lines under NaHCO3（pH 8.0）treatment

图2　NaHCO3（pH 8.0）胁迫对转基因苜蓿幼苗期影响Fig.2Effect of NaHCO3stress assays（pH 8.0）on transgenic alfalfa seedling stage

进一步比较转基因苜蓿叶绿素、丙二醛、膜相对电导率处理前后变化量（见图3），株系rd-DREB2A叶绿素、相对电导率生理参数变化量明显小于株系35S-DREB2A。结果表明，轻度碱处理条件下，AtDREB2A诱导表达对植株细胞保护作用优于AtDREB2A超量表达。

2.2.2成苗期耐碱性分析

选取长势一致1年龄成苗苜蓿，分别定植于正常土壤∶盐碱土=16∶1的混合盐碱土（pH 9.3）中。处理80 d后，非转基因苜蓿出现叶片部分枯萎、死亡现象，而转基因苜蓿部分植株叶片仅少部分发黄。在表型上，与50 mmol·L-1NaHCO3（pH 8.0）胁迫的幼苗期相似，2个转基因群体耐碱程度无显著差异（见图4）。

统计胁迫80 d后成活率及持续胁迫后进入开花期株系数量，2个转基因群体差异显著（见表1）。

AtDREB2A的诱导表达更有利于转基因苜蓿耐碱性提高，并不影响植株正常生长和繁殖。调查胁迫处理80 d后，转基因苜蓿各株系叶绿素、丙二醛、相对电导率及根系活力（见图5），各株系处理前后的变化量差异显著。结果表明，中度碱处理条件下，AtDREB2A的诱导表达，使植株膜脂过氧化程度、质膜损伤程度、根系活力变化均低于AtDREB2A超量表达，随pH增加，诱导型启动子rd29A调控的转基因苜蓿耐碱性未下降。

图3　NaHCO3（pH 8.0）处理14 d后转基因苜蓿幼苗叶绿素含量、相对电导率及丙二醛含量变化量Fig.3Changes of the chlorophyll content，relative conductivity and malondialdehyde content in transgenic alfalfa seedlings of transgenic alfalfa in NaHCO3（pH 8.0）treatment for 14 days

图4　盐碱土（pH 9.3）对转基因苜蓿成苗期影响Fig.4Effect of saline-alkali soil（pH 9.3）treatment on transgenic alfalfa adult stage

表1　盐碱土对转基因苜蓿生长发育影响Table 1Effect of saline-alkali soil on transgenic alfalfa growth development

图5　盐碱土（pH 9.3）处理前后转基因苜蓿幼苗叶绿素含量、相对电导率、丙二醛含量和根系活力变化量Fig.5Changes of the chlorophyll content，relative conductivity，malondialdehyde content and root activity of transgenic alfalfa in the saline-alkali soil（pH 9.3）treatment for 80 days

3　讨论

目前，植物转基因育种研究中，为提高外源基因表达量，超量表达启动子的应用较为普遍［25］，仅有少数材料选择种子特异性启动子、叶绿体组织表达启动子［26］等组织特异性启动子，而环境因素诱导型启动子的应用较少［27］。研究发现，两种不同启动子调控的转基因植株生长及碱胁迫抗性，存在以下差异：一是基因表达存在差异。在正常生长情况下，由于rd29A启动子为环境诱导型启动子，启动子未发挥调控作用，AtDREB2A基因表达量低；而CaMV-35S启动子为转基因育种中常用的超量表达启动子，为组成型启动子，其调控基因在正常生长情况下表达量为非转基因的38倍。碱胁迫诱导后，两转基因株系中AtDREB2A基因表达量均上调，但rd29A启动子被诱导，发挥调控功能，AtDREB2A基因上调表达，是非转基因株系20.7倍；CaMV-35S启动子调控的AtDREB2A基因在正常生长调控基础上，也有上调表达，达到非转基因株系57.6倍。二是转基因植株生长状态。正常生长环境及在碱胁迫条件下，CaMV-35S启动子调控AtDREB2A的转基因株系（35S-D）生长发育均不如诱导型启动子调控转基因株系rd-D表现，尤其在持续性碱胁迫下，即在成苗期盐碱土生长环境中，可见35S-D植株成活率和开花植株数明显低于rd-D株系（见表1），其他生理指标也存在较大差异（见图3、5）。由此表明，AtDREB2A转录因子基因持续超量表达会影响植株生长发育，而At⁃DREB2A的诱导表达并不影响植株正常生长发育。Ito等研究也得到类似结果，并提出对于转录因子等调节基因，其持续超量表达会影响植株正常生长发育［24］。

AtDREB2A基因超量表达对植株生长发育有负面影响，推测可能存在以下两种原因。Qin等报道表明，DREB2A转录因子，在蛋白水平调控存在泛素化降解过程。即其调控下游基因表达功能后，将通过泛素化过程被降解，这种调控比较科学，与多种代谢途径相关联［28］。因此，该基因持续过量表达会影响细胞内基因、蛋白及生理代谢过程变化，最终影响植株生长及抗逆性。另外，研究报道，DREB类转录因子之间存在相互调控关系，这种调控关系维持DREB蛋白量［29］。本研究中也发现，rd29A启动子调控的转基因株系在未经处理时，DREB基因也有少量表达；经碱胁迫处理后，35S调控的转基因株系中DREB基因表达也明显提高。由此表明内源DREB基因存在，且在碱胁迫下上调表达。AtDREB2A超量表达势必会对苜蓿内源DREB类转录因子表达及蛋白含量产生影响，破坏DREB类蛋白平衡，产生消极影响，最终引起植株正常生长发育和耐碱性发挥。

植物对非生物胁迫响应是多基因表达调控的结果，对任一基因操纵均会导致大量相关基因及相应蛋白产物发生改变。在植物耐盐碱性基因工程研究中，要尽可能减少这些改变，适时激活胁迫应答基因表达。即在无胁迫条件下尽量降低外源基因表达量，控制表达时间和丰度；而在外界环境变化时，转基因植株才表现其抗逆优势，在确保作物产量同时提高其耐逆性。这也是转基因植物安全评价中“实质等同”原则的实质所在。针对这一要求，适当选择诱导型启动子是有效手段。rd29A是胁迫诱导型启动子，在低温、干旱、高盐等胁迫条件下诱导表达。利用胁迫诱导启动子rd29A代替超量表达启动子，可使外源调控基因仅在植物遭受外界胁迫时，在植物中超表达，消除在正常生长条件下外源基因超表达对植物的不利影响［30］。本研究发现，转基因株系rd-D生长及耐碱性均优于35S-D，且这种耐碱性随盐碱程度增加并未下降。另外，rd29A启动子作用不仅局限于转录因子基因耐逆基因工程领域，对蛋白激酶、离子通道蛋白等基因异源表达调控同样有效［30-32］。因此，利用rd29A启动子和调控基因组合，可有效提高苜蓿耐碱能力，为耐盐碱苜蓿基因工程研究提供新途径。

4　结论

rd29A启动子和CaMV-35S启动子调控At⁃DREB2A表达存在明显差异，且rd29A启动子调控的转基因苜蓿生长及对碱的耐逆性均优于CaMV-35S启动子，其耐碱性并未随碱程度增加而下降，rd29A启动子与AtDREB2A可共同应用于植物耐碱基因工程。

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Alkaline tolerance analysis of transgenic alfalfa withAtDREB2Agene regulated by rd29A and CaMV-35S promoter

CAI Hua，SONG Tingting，ZHANG Dayang
（School of Life Sciences，NortheastAgricultural University，Harbin 150030，China）

rd29A or CaMV-35S promoter is widely used in plant genetic engineering，but the effect of regulation is different in transgenic plants with different genes.Real-time PCR was used to assess different expression level ofAtDREB2Agene in transgenic alfalfa lines regulated by rd29A and CaMV-35S promoters，respectively.For alkaline stress treatments，at the seedling stage plants were treated with 50 mmol·L-1NaHCO3（pH 8.0）stress and in mixed alkali soil（pH 9.3），then，the phenotype of the plants and the survival rate were observed，and physiological indicators including chlorophyll，relative conductivity，MDA and root activity were investigated.The results showed that an obvious difference in the regulation of geneexpression ofAtDREB2Aby rd29A and CaMV-35S promoters was observed.AtDREB2Agene was overexpressed under the regulation of CaMV-35S promoter，after alkaline stress treatment for 1 h，the expression ofAtDREB2Agene increased significantly，increased by 57.6-fold.But the expression of AtDREB2A gene in the rd29A-lines was not as high as that of the lines with 35S-AtDREB2Agene（only 20.7-fold）.It was deduced thatAtDREB2Agene overexpression inhibited the normal growth of transgenic alfalfa.Alkali stress resisitance ofAtDREB2Agene induced expression was better thanAtDREB2Agene overexpression in transgenic alfalfas.The reduction of chlorophyll content，relative conductivity，MDA and root activity in transgenic alfalfa with rd29A promoter were significantly less than that with CaMV-35S promoter.The aim of this study was to compare the alkaline tolerance of transgenic alfalfa withAtDREB2A （AB007791）gene regulated by different promoters，and to provide an effective method of application of alkali-stress genetic engineering withAtDREB2Agenes in alfalfa.

alfalfa；AtDREB2Agene；rd29Apromoter；alkaline tolerance；transgenic

S541.9

A

1005-9369（2016）09-0016-08

2016-05-19

教育部高等学校博士学科专项科研基金（20132325120017）；国家自然科学青年基金项目（31302022）

才华（1979-），女，副教授，博士，研究方向为苜蓿耐逆基因工程与分子生物学。E-mail：caihuaneau@sohu.com