阿魏菇菌丝体多糖的分离纯化研究

陈恒雷，林增祥，吕长武

（新疆大学物理学院低能离子注入与生物工程实验室，新疆乌鲁木齐830046）

阿魏菇菌丝体多糖的分离纯化研究

陈恒雷，林增祥，吕长武*

（新疆大学物理学院低能离子注入与生物工程实验室，新疆乌鲁木齐830046）

以液体发酵获得的阿魏菇菌丝体为材料，开展了阿魏菇菌丝体多糖分离纯化及纯度鉴定研究。结果表明，料液以质量体积比1∶15（g/mL）、提取温度100℃、提取时间3h、提取次数3次，热水浸提，用孔径38 μm的尼龙布过滤，加入适量20%三氯乙酸去蛋白，5倍体积于多糖浓缩液的无水乙醇醇析10h，10%的H2O2脱色8 h和DEAE-52柱层析纯化处理得到的阿魏菇菌丝体多糖，经吸收光谱扫描不含蛋白、核酸及色素残留，经红外光谱扫描初步判定其为糖类物质，且含有β-糖苷键。

阿魏菇；菌丝体多糖；分离；纯化；波谱分析

阿魏菇（Pleurotus ferulae lanzi）又名阿魏侧耳、阿魏蘑菇、白灵菇，因寄生或腐生在新疆干旱草原药用植物阿魏或刺芹、阔叶拉瑟草植物上而得名［1］。它集食用、药用价值于一身，被学者美誉为当今食用菌皇后，在食用菌族中独秀一枝，与另一种高档药食两用菌—羊肚菌并称为姊妹菌［2］。阿魏菇生物活性有效组分食药用真菌多糖的含量很高［3］，其子实体多糖和液态深层发酵培养过程中产生的真菌多糖具有增强机体免疫力［4-5］、抗肿瘤［6-7］等功效。目前，阿魏菇多糖的药用价值及其应用已为世界各国重视，极具开发前景。本研究以液体发酵获得的阿魏菇菌丝体为材料，开展了阿魏菇多糖分离纯化及纯度鉴定研究，以期为该真菌多糖的应用开发提供试验参考。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1原料

阿魏菇菌丝体：通过XWB-5L生化反应器液体发酵所得。

1.1.2试剂

考马斯亮蓝（分析纯）：上海恒远生物科技有限公司；葡萄糖（分析纯）、酪氨酸（分析纯）、苯酚（分析纯）、浓硫酸（分析纯）、氯仿（分析纯）、三氯乙酸（分析纯）、正丁醇（分析纯）、无水乙醇（分析纯）、双氧水（分析纯）、浓氨水（分析纯）、NaCl（分析纯）、KBr（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.1.3仪器

XWB-5L生化反应器：南京新凯龙生物工程有限公司；ZFQ81-1型旋转蒸发器：上海医械专机厂；HH-2电热恒温水浴锅：天津汇科仪器设备有限公司；HL-2恒流泵和BSZ-100自动部分收集器：上海精科实业有限公司；层析柱（50 cm×2.6 cm）：上海厦美生化科技发展有限公司；DEAE-52纤维素：南京森贝伽生物科技有限公司；UV-2100型紫外-可见分光光度计：尤尼柯（上海）仪器有限公司；AVATAR-370傅立叶红外光谱仪：上海禾工科学仪器有限公司。

1.2方法

1.2.1阿魏菇菌丝体多糖的制备方法

称取10.0 g阿魏菇鲜菌丝体，料液以质量体积比1∶15（g/mL）、提取温度100℃、提取时间3 h、提取次数3次热水浸提，用孔径38 μm的尼龙布过滤备用。

1.2.1.1脱蛋白

将浸提后的多糖液放入-20℃冰柜中，冰冻之后融化，过滤除去不溶沉淀。分别用Sevage法［8］、三氯乙酸-正丁醇法和20%三氯乙酸法去蛋白，用考马斯亮蓝结合法［9］测量离心后多糖溶液中的蛋白质含量，比较3种脱蛋白方法的试验效果。

1.2.1.2醇析

1）乙醇浓度对多糖得率的影响

取20 mL菌丝体多糖浓缩液，分别加入1、2、3、4、5、6倍体积无水乙醇，静置过夜后6 000 r/min离心15 min，取沉淀加水复溶后用苯酚-浓硫酸法［9］测量多糖含量。

2）醇析时间对多糖得率的影响

取11份10 mL多糖浓缩液，加入4倍体积无水乙醇，每隔1 h取一个样品，6 000 r/min离心15 min，取沉淀加水复溶后用苯酚-浓硫酸法测量多糖含量。

1.2.1.3H2O2脱色

取200 mL多糖溶液，加入20 mLH2O2，滴加氨水至pH值8.5，每隔1 h，600 nm波长测量OD值，以蒸馏水做空白参照，观测时间与脱色效果的关系。

1.2.1.4DEAE-52柱层析

先用柠檬酸起始缓冲液对50 mg阿魏菇菌丝体多糖在4℃平衡过夜，中间换液3次。用吸管将经过平衡的纤维素柱上部缓冲液吸出，留有一薄层液面以免空气进入。沿管壁缓缓加入多糖样品，拧开下端的螺旋夹，使多糖样品进入交换剂中，快加完样时，加2 mL柠檬酸缓冲液冲洗柱壁，随即采用0～1 mol/L NaCl梯度洗脱，利用自动分步收集器收集，当多糖液流出时，开始分管收集，至无多糖为止，以苯酚-浓硫酸法测洗脱液多糖含量。

1.2.2阿魏菇菌丝体多糖的纯度鉴定

1.2.2.1阿魏菇菌丝体多糖的吸收光谱扫描

取2 mg/mL阿魏菇菌丝体多糖溶液，进行全波段扫描，水为空白对照，以确定经过纯化后多糖溶液中是否有蛋白质、核酸和色素残留。

1.2.2.2阿魏菇菌丝体多糖的红外光谱扫描

取1 mg左右干燥的菌丝体多糖样品，与200 mg左右经干燥的KBr粉末，在红外灯下在玛瑙研钵中轻轻研匀，然后对阿魏菇菌丝体多糖进行红外光谱扫描，扫描范围400 cm-1～4 000 cm-1。

2结果与分析

2.1阿魏菇菌丝体多糖的分离纯化试验结果

2.1.13种脱蛋白方法的试验比较

3种脱蛋白方法的试验比较见图1。

图13　种脱蛋白方法的比较结果Fig.1Result of comparing three removing protein methods

由试验结果发现，三氯乙酸法脱蛋白效果最好，其原因可能是用三氯乙酸脱蛋白时，因三氯乙酸和多糖水溶液互溶，大大增加了三氯乙酸作用于蛋白质分子的概率，使多糖溶液中蛋白质充分变性、絮状析出，通过离心作用使絮状物充分沉淀，将蛋白质从多糖溶液中分离出来；而三氯乙酸-正丁醇脱蛋白时，因正丁醇与水的极性不同会形成分界层，析出的蛋白质不溶于正丁醇和水，所以整个溶液体系分为3层，上层为正丁醇液，下层为水合三氯乙酸，中间为蛋白质沉淀，萃取过程中对沉淀物的分离效果不如离心法好，相对去蛋白效果差一些。Sevage法条件温和效果也不错，且萃取剂可以重复使用，但需要经过多次萃取效果比较理想。

2.1.2醇析试验结果

2.1.2.1乙醇浓度对多糖得率的影响

乙醇浓度对多糖得率的影响见图2。

图2　乙醇浓度对多糖得率的影响Fig.2Effect of ethanol concentration on yield of polysaccharide

通过乙醇浓度对多糖得率影响的试验结果，发现当加入5倍体积乙醇时，多糖沉淀质量不再增加，适宜作为阿魏菇菌丝体多糖沉积的醇析浓度。

2.1.2.2醇析时间对多糖得率的影响

醇析时间对多糖得率的影响见图3。

图3　醇析时间对多糖得率的影响Fig.3Effect of polysaccharide precipitation time on yield of polysaccharide

通过醇析时间对菌丝体多糖得率影响的试验结果，发现醇析8 h后多糖沉淀增加较少，以醇析时间10 h效果较好。

2.1.3H2O2脱色试验结果

H2O2脱色试验结果见图4。

图4　H2O2脱色时间曲线Fig.4Time curve of H2O2bleaching

对图4结果分析，可以发现H2O2脱色时间与脱色效果线性相关，前6 h脱色速度稍快，然后随时间延长吸光度减少缓慢，因此选择8 h为脱色时间。通过拟合后得到脱色方程为：Y=0.005 6X2-0.057 4X+1.623 2（式中：Y为600 nm OD值；X为时间，R2=0.997 3）。

2.1.4DEAE-52柱层析试验结果

DEAE-52柱层析试验结果见图5。

图5　菌丝体多糖的DEAE-52分离结果Fig.5Results of mycelium polysaccharide separation with DEAE-52

通过图5可以看出，从0～1 mol/L NaCl的浓度范围，层析柱吸附多糖都有洗脱，从第4管洗脱量逐渐增加到第12管开始减少，25管到40管洗脱量较少，40管之后出现一个大的洗脱峰，60管之后多糖基本洗脱完毕。

2.2阿魏菇菌丝体多糖的纯度鉴定试验结果

2.2.1阿魏菇菌丝体多糖的吸收光谱扫描

阿魏菇菌丝体多糖的吸收光谱扫描见图6。

图6　阿魏菇菌丝体多糖的吸收光谱扫描Fig.6Absorption spectrum scanning of Pleurotus mycelium polysaccharide

通过对上图我们可以看出，在280 nm和260 nm处无吸收峰，可以判断样品中不含有蛋白质和核酸；在620 nm处也没有吸收峰，可以判断样品中没有色素残留。

2.2.2阿魏菇菌丝体多糖的红外光谱扫描

阿魏菇菌丝体多糖的红外光谱扫描见图7。

通过菌丝体多糖的红外扫描谱图可以看出，在3 322 cm-1的一个宽峰是-O-H伸缩振动，存在分子间和分子内的氢键，2 926 cm-1的吸收峰是-C-H伸缩振动，1 400 cm-1～1 200 cm-1的一些峰是-C-H的变角振动，通过这两组糖类物质特征吸收峰则可以初步判断该样品是糖类物质。在1 100 cm-1～1 010 cm-1处的3个吸收峰是吡喃糖苷特征吸收峰，1 000 cm-1～1 200 cm-1间比较大的吸收峰是由两种C-O伸缩振动所引起的，其中一种属于C-O-H的，另外一种是糖环的C-O-C，876 cm-1～905 cm-1处的吸收峰，是β-D-吡喃糖C-H变角振动的特征吸收峰，表明有β-糖苷键。

图7　阿魏菇菌丝体多糖的红外光谱扫描Fig.7IR Scan of Pleurotus mycelium polysaccharide

3结论

阿魏菇是近几年发展起来的食用菌新秀之一，国内的研究重点已经由阿魏菇的菌种的驯化及栽培转移到其真菌多糖的深层发酵、提取及分离纯化等方面。本研究基于课题组近期的优化提取工艺参数：料液以质量体积比1∶15（g/mL）、提取温度100℃、提取时间3 h、提取次数3次，热水浸提阿魏菇菌丝体多糖。通过脱蛋白、醇析、H2O2脱色和DEAE-52柱层析比较试验获得了阿魏菇菌丝体多糖分离纯化工艺参数：用孔径38 μm的尼龙布过滤，将过滤后的多糖溶液加入适量20%三氯乙酸去蛋白，离心除去不溶沉淀；然后减压浓缩，再用5倍体积于多糖浓缩溶液的无水乙醇醇析10 h，10%的H2O2脱色8 h，每10 g阿魏菇鲜菌丝体可提取538.3 mg粗多糖；最后上DEAE-52阴离子纤维素层析柱纯化，得阿魏菇菌丝体纯多糖得率是19.6 mg/100 mg。以该工艺参数制备的阿魏菇菌丝体多糖通过吸收光谱扫描，其不含有蛋白质、核酸和色素残留；通过红外光谱扫描，初步判定其为糖类物质，且含有β-糖苷键。

［1］陈忠纯，吴政声.阿魏侧耳优良菌株KH2的选育［J］.干旱区研究，1994，11（4）：76-78

［2］武红旗，李志宏，范燕敏，等.新疆阿魏菇及发展展望［J］.食用菌，2004，26（1）：7-8

［3］黄年来.18种珍稀美味食用菌栽培［M］.北京：中国农业出版社：1-164

［4］赵祁，肖杰，王勤.阿魏菇对小鼠免疫功能的影响［J］.中国食用菌，2001，20（1）：43-45

［5］甘勇，吕作舟.阿魏菇多糖理化性质及免疫活性研究［J］.菌物系统，2001，20（2）：228-232

［6］宋旭红，张月明，邓红.新疆阿魏蘑菇提取物体外肿瘤实验研究［J］.癌变·畸变·突变，2002，14（2）：107-110

［7］董洪新，吕作舟.阿魏侧耳多糖的分离纯化与抗肿瘤活性的研究［J］.微生物学通报，2003，30（2）：16-19

［8］Sevag M G，Lackman D B，Smolens J.The isolation of components of streptococcal nucleoproteins in serologically active form［J］.Journal of Biological Chemistry，1938，124：425

［9］张惟杰.复合多糖生化研究技术（2版）［M］.杭州：浙江大学出版社，1999：10-11

Separation and Purification of Pleurotus Mycelium Polysaccharide

CHEN Heng-lei，LIN Zeng-xiang，LÜ Chang-wu*
（Laboratory of Low Energy Ion Implantation and Biological Engineering，School of Physics Science and Technology，Xinjiang University，Urumqi 830046，Xinjiang，China）

Taking Pleurotus mycelium obtained through liquid fermentation as materials，the separation，purification and identification of Pleurotus mycelium polysaccharide were also made.The results showed that the fresh mycelium was extracted with deionized water［material-water ratio：1∶15（g/mL），extraction temperature：100℃，extraction time：3 h and extraction degree：3 times］，then the supernatant was separated from insoluble residue with nylon cloth（pore diameter 38 μm）.The extracts were then removed protein by the addition of suitable 20%trichloroacetic acid，precipitated by the addition of anhydrous ethanol（ethanol-polysaccharide concentration ratio 5∶1，precipitation time 10 h），and the precipitates were collected by centrifugation，then solubilized in deionized water and bleached with 10%H2O2to get the crude polysaccharides.And then the crude polysaccharides were purified with DEAE-52 column chromatography to get the mycelium polysaccharides.The mycelium polysaccharides did not contain proteins，nucleic acids and pigment residue by absorption spectrum scanning，were determined initially as carbohydrate and contained a β-glycosidic bond by IR scan.

Pleurotusferulae；myceliumpolysaccharide；separation；purification；spectrumanalysis

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.19.011

2015-11-19

新疆维吾尔自治区青年科技创新人才培养工程项目（2013721007）

陈恒雷（1979—），男（汉），副教授，博士后，研究方向：离子束生物工程、食药用菌诱变育种与开发、天然产物研究与开发。*通信作者