激动素对衰老模型小鼠免疫力的影响研究

武莹莹，李梦云，宋格格，闫小兰，张克喆，王 刚

（河南科技大学，河南 洛阳 471023）

激动素对衰老模型小鼠免疫力的影响研究

武莹莹，李梦云，宋格格，闫小兰，张克喆，王 刚

（河南科技大学，河南 洛阳 471023）

为研究激动素（Kn）对衰老模型小鼠免疫力的影响，将50只昆明系小白鼠随机分为衰老模型对照组、激动素处理组（低、中、高剂量组）、青年对照组，每组10只，雌雄各半。衰老模型对照组、激动素处理组小鼠背部皮下连续45 d注射D-半乳糖［125 mg/（kg·BW）］制备衰老模型，1次/d。试验第11天时，低、中、高剂量激动素处理组小鼠分别腹腔注射5、10、20 mg/（kg·BW）的激动素溶液，1次/d，直至第45天；同时期内衰老模型对照组和青年对照组小鼠颈背部皮肤注射生理盐水。试验结束时，计算各组小鼠脾指数，检测脾脏SOD、CAT、GSH-PX活性及MDA含量，检测血清IL-2、IL-6以及IgA、IgG、IgM含量。结果表明，经激动素处理后，小鼠的脾指数显著或极显著高于衰老模型对照组（P<0.05或P<0.01）；3种抗氧化酶活性与衰老模型对照组相比有所提高，其中高剂量组的提高作用最为显著（P<0.01）；代谢物MDA含量显著或极显著低于衰老模型对照组（P<0.05或P<0.01）；血清IL-2含量显著或极显著高于衰老模型对照组（P<0.05或P<0.01），血清IL-6含量显著或极显著低于衰老模型对照组（P<0.05或P<0.01），3种血清球蛋白含量与衰老模型对照组相比均有所提高，其中高剂量组的提高作用最为显著（P<0.01）。综上提示，激动素具有显著的延缓衰老、抗氧化损伤、提高免疫力的作用。

激动素；衰老；小鼠；脾脏；免疫力

机体衰老后各个系统的组织器官会发生不同 程度的功能下降和萎缩，如皮肤松弛、毛发变白、记忆力降低、免疫应答能力下降等［1］。目前，全世界已进入老龄化社会，衰老和抗衰老问题成为目前学者研究的热点之一。激动素（kinetin，Kn）是首个被发现的具有促进细胞分裂、抗氧化和抗衰老作用的嘌呤类衍生物［2-3］。综合国内外研究发现，激动素作为腺嘌呤类衍生物的代表，已成为抗氧化、抗衰老领域的研究热点。激动素不仅在植物上有广泛的应用，在动物界也有关于其抗氧化损伤和抗衰老作用方面的研究，多数集中于动物的心脏、肝脏、睾丸、卵巢、子宫、皮肤、乳腺等［4-6］，而对于免疫器官的抗衰老作用研究较少。脾脏是动物体内重要的免疫器官，而激动素对于脾脏免疫功能的影响及其作用机制尚未探明。该研究旨在通过评价激动素对衰老模型小鼠脾脏抗氧化酶活性、血清关键细胞因子及免疫球蛋白含量的影响，为进一步阐明激动素抗氧化及抗衰老的作用机制及激动素相关产品的开发提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 实验动物：2月龄健康昆明系小白鼠50只，体重为18～22 g，雌雄各半，由河南科技大学实验动物中心提供，合格证号：2014-2013。

1.1.2 药品与试剂：激动素、D-半乳糖，购自Sigma公司；超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）、丙二醛（MDA）考马斯亮蓝试剂盒，购自南京建成生物工程研究所；白细胞介素 2（IL-2）、白细胞介素 6（IL-6）、免疫球蛋白 A（IgA）、免疫球蛋白 G（IgG）、免疫球蛋白 M（IgM）ELISA检测试剂盒，购自欣博盛生物科技有限公司。

1.1.3 主要仪器设备：JA2003电子天平（0.001 g），购自上海上天精密仪器有限公司；玻璃匀浆器，购自海门弘澄实验器材制造有限公司；SHIMADZUUV2450型紫外分光光度计；ELx800 BioTek酶标仪。

1.2 试验方法

1.2.1 动物分组与处理：将50只昆明系小白鼠随机分为5组，分别为衰老模型对照组、激动素处理组（低、中、高剂量组）、青年对照组，每组10只，雌雄各半。衰老模型对照组、激动素处理组小鼠连续45 d 背部皮下注射 D-半乳糖（D-gal）［125 mg/（kg·BW）］制备衰老模型，1次/d，青年对照组小鼠连续45 d颈背部皮下注射生理盐水，1次/d。试验第11天时，低、中、高剂量激动素处理组小鼠分别腹腔注射 5、10、20 mg/（kg·BW） 的激动素溶液，1 次/d，持续至第45天，同时期内衰老模型对照组和青年对照组小鼠颈背部皮下注射生理盐水，1次/d。

1.2.2 血清的制备：试验第45天时，采用眼球采血法采集各组小鼠血液，分离血清。

1.2.3 脾指数的计算：采血后处死小鼠，无菌摘取小鼠的脾组织，称重并计算脾指数。脾指数（mg/g）=脾重量（mg）/体重（g）。

1.2.4 抗氧化酶活性及脂质过氧化物酶代谢产物的检测：制备脾组织匀浆，测定其抗氧化酶SOD、CAT、GSH-PX活性及脂质过氧化物酶代谢产物MDA含量。整个过程严格按照试剂盒说明书操作。

1.2.5 血清免疫因子IL-2和IL-6的检测：取分离的血清，采用双抗体夹心ELISA法检测免疫因子IL-2、IL-6 含量。

1.2.6 血清免疫球蛋白的检测：采用免疫比浊法检测各组小鼠血清中的IgA、IgG、IgM含量。

1.3 数据处理 试验数据采用SPSS 20.0统计软件进行单因素方差分析（One-way ANOVA)，试验组与对照组之间的差异显著性采用Duncan′s检验法。P＞0.05时认为差异不显著，P＜0.05时认为差异显著，P＜0.01时认为差异极显著。所有数据用X±SE表示。

2 结果与分析

2.1 脾指数 由表1可知，衰老模型对照组小鼠脾指数与青年对照组比较极显著下降（P＜0.01），表明模型制备成功。低剂量激动素组小鼠脾指数显著高于衰老模型对照组（P＜0.05），中、高剂量激动素组小鼠脾指数极显著高于衰老模型对照组（P＜0.01），且各激动素处理组小鼠脾指数与青年对照组相比，差异均不显著（P＞0.05），表明激动素处理组小鼠脾脏发育明显好转，萎缩受到抑制。

表1 激动素对各组小鼠脾指数的影响

表2 各组小鼠脾脏抗氧化酶活性和脂质过氧化物酶代谢产物含量的检测结果

表3 各组小鼠血清免疫因子IL-2和IL-6含量的检测结果

2.2 抗氧化酶活性及脂质过氧化物酶代谢产物含量 由表2可知，衰老模型对照组小鼠SOD、CAT、GSH-PX活性与青年对照组相比均极显著降低（P<0.01）。经激动素处理后，小鼠的3种抗氧化酶活性与衰老模型对照组相比有所提高，其中高剂量组的提高作用最为明显，与青年对照组相比差异不显著（P＞0.05）。衰老模型对照组小鼠脾脏MDA含量较青年对照组明显升高，二者差异极显著（P<0.01）。经激动素处理后，小鼠的MDA含量有所下降，低剂量激动素处理组小鼠脾脏的MDA含量显著低于衰老模型对照组（P<0.05），中、高剂量组小鼠脾脏的MDA含量极显著低于衰老模型对照组（P<0.01），且中、高剂量组小鼠脾脏的MDA含量与青年对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

2.3 血清免疫因子IL-2、IL-6含量 由表3可知，衰老模型对照组小鼠与青年对照组比较，血清IL-2含量显著降低 （P<0.01），IL-6含量显著上升（P<0.01）。使用不同剂量的激动素处理后，血清IL-2含量呈剂量依赖性升高，IL-6含量呈剂量依赖性降低，中、高剂量组小鼠血清的IL-2、IL-6含量与衰老模型对照组相比差异均极显著（P<0.01），高剂量组小鼠血清IL-2、IL-6含量与青年对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

2.4 血清免疫球蛋白含量 由表4可知，衰老模型对照组小鼠与青年对照组相比，血清IgG、IgA、IgM含量显著降低，差异极显著（P<0.01）。激动素处理组血清IgG、IgA、IgM含量较衰老模型对照组升高，其中，激动素高剂量组与衰老模型对照组相比差异极显著（P<0.01），而与青年对照组相比差异不显著（P＞0.05）。

3 讨论

机体衰老后，体内SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶的活性降低，代谢产生的自由基在体内过多滞留，引起组织细胞结构损伤，进而影响其生理功能的正常发挥［7］。脾脏作为重要的免疫器官，其随着年龄的增长逐渐衰退与萎缩，结构发生变化，导致淋巴细胞减少，抗氧化能力降低，合成分泌IL-2和免疫球蛋白等关键免疫因子的能力降低［8-9］。

激动素是一种腺嘌呤类衍生物，具有显著的抗氧化、抗衰老的作用。 Tsukiyama 等［10］研究证明，激动素具有明显的抗皮肤衰老作用，Celik等［11］也研究发现，激动素能够保护由Fenton反应系统引起的DNA氧化损伤作用。该试验结果显示，衰老模型对照组小鼠的脾脏发生萎缩，脾指数较青年对照组显著降低 （P<0.01），SOD、GSH-PX、CAT 酶活性显著降低（P<0.01），经激动素处理后，小鼠脾指数回升，SOD等抗氧化酶活性较衰老模型对照组有所提高，其中激动素高剂量组的升高作用最为显著 （P<0.01）。衰老模型对照组小鼠脾脏MDA含量较青年对照组明显升高，差异极显著（P<0.01），经激动素处理后，MDA含量与衰老模型对照组比较显著下降（P<0.05或P<0.01）。结果提示，激动素能够抑制由衰老而导致的脾萎缩，提高SOD、GSH-PX、CAT等抗氧化酶活性，有助于清除血清脂质过氧化物酶代谢产物MDA，从而有效抑制自由基对组织细胞结构的损伤。

IL-2、IL-6由淋巴细胞分泌产生，在免疫调节中起着举足轻重的作用。IL-2缺少是老年人免疫缺陷的根本原因，IL-6升高是提示老年人发生感染的重要指标。机体衰老后，IL-2含量下降，IL-6含量上升［12-14］。该研究结果显示，衰老模型对照组小鼠血清IL-2含量较青年对照组显著降低 （P<0.01），IL-6含量较青年对照组显著上升（P<0.01）。使用不同浓度的激动素处理后，低、中、高剂量组小鼠的IL-2表达有所回升，IL-6表达有所下降，表明激动素能够在一定程度上抑制脾的萎缩，提高机体的免疫力。

表4 各组小鼠血清免疫球蛋白含量的检测结果

体外研究表明，激动素能够有效抵抗人类成纤维细胞的衰老并能影响细胞形态和内部骨架结构，从而起到延缓细胞衰老的作用［15］。该研究结果显示，衰老模型对照组小鼠的血清IgA、IgG、IgM含量与青年对照组相比显著降低（P<0.01）。激动素处理后各组小鼠的免疫球蛋白含量升高，表明激动素能增强机体的免疫功能。

综上提示，激动素能够提高衰老模型小鼠脾组织的抗氧化酶活性，提高血清IL-2及免疫蛋白含量，降低脾脏MDA含量及血清IL-6含量，从而发挥延缓衰老、提高机体免疫能力的作用。

［1］AW D，SILVA A B，PALMER D B.Is thymocyte development functional in the aged［J］.Aging， 2009，1（2）：146-153.

［2］MALECKI P H，RYPNIEWSKI W，SZYMAN＇SKI M，et al.Binding of the plant hormone kinetin in the active site of mistletoe lectinⅠfrom Viscum album［J］.Biochim Biophys Acta，2012，1824（2）： 334-338.

［3］DUDZIK P，DULIN＇SKA-LITEWKA J，WYSZKO E，et al.Effects of kinetin riboside on proliferation and proapoptotic activities in human normal and cancer cell lines ［J］.J Cell Biochem，2011，112（8）：2115-2124.

［4］张黎，欧阳五庆，胡颖，等.玉米幼芽提取物对家蚕抗氧化损伤作用的影响 ［J］. 蚕业科学，2005，31 （4）：458-462.

［5］杨戈，欧阳五庆，杨光敏，等.玉米幼芽提取物对衰老小鼠心肌自由基代谢和超微结构的影响［J］.西北农林科技大学学报：自然科学版，2007，35（2）：23-26.

［6］唐立刚.激动素对大鼠乳腺的作用及相关机制研究［D］.杨凌：西北农林科技大学，2012.

［7］MIQUEL J，RAMÍREZ-BOSCÁ A，RAMÍREZ-BOSCA J V，et al.Menopause：a review on the role of oxygen stress and favorable effects of dietary antioxidants ［J］.Arch Gerontol Geriatr，2006，42（3）：289-306.

［8］SHEN H，ZHANG W，ABRAHAM C，et al.Age and CD161 expression contribute to inter-individual variation in interleukin-23 response in CD8+memory human T cells［J］.PLoS One，2013，8（3）：e57746.

［9］芦琳琳.红景天苷的抗衰老作用：口服红景天苷改善老龄大鼠免疫反应和增强谷氨酰半胱氨酸连接酶活性［D］.青岛：中国海洋大学，2013.

［10］TSUKIYAMA M T，SUGITA.Recent development of anti-aging plant agents and application to cosmetics［J］.Fragrance J，2010，38（9）：21-26.

［11］CELIK I， TULUCE Y，TURKER M.Antioxidant and immune potential marker enzymes assessment in the various tissues of rats exposed to indoleacetic acid and kinetin：A drinking water study ［J］.Pestic Biochem Phys，2006，86（3）：180-185.

［12］包伍叶，斯钦图.蒙医灸疗对衰老模型大鼠血清SOD、MDA的影响 ［J］.内蒙古民族大学报：自然科学版，2008，23（1）：75-76.

［13］MENEGUELLO -COUTINHO M，CAPERUTO E，BACURAU A V，et al.Effects of dietary restriction or swimming on lymphocytes and macrophages functionality from old rats ［J］.Immunol Invest，2014， 43 （2）：113-122.

［14］CIARAMELLA A，SPALLETTA G，BIZZONI F，et al.Effect of age on surface molecules and cytokine expression in human dendritic cells ［J］.Cell Immunol，2011，269（2）：82-89.

［15］MIK V，SZÜCˇOVÁ L，SˇMEHILOVÁM，et al.N9-substituted derivatives of kinetin:effective anti-senescence agents［J］.Phytochemistry，2011，72（8）：821-831.

Effect of Kinetin on Immunity of Aging Model Mice

WU Ying-ying，LI Meng-yun，SONG Ge-ge，YAN Xiao-lan，ZHANG Ke-zhe，WANG Gang
（Henan University of Science and Technology，Luoyang 471023，China）

In order to investigate the effect of kinetin on immunity of aging model mice,a total of 50 mice of Kunming strain were selected and divided into aging model control group,low dosage kinetin group,moderate dosage kinetin group,high dosage kinetin group,and young control group.There were 10 mice in each group with half males and half females.The mice in aging model control group and kinetin treatment groups were subcutaneously administrated 125 mg/（kg·BW）of D-galactose once daily on the back for consecutive 45 d.On day 11,the mice in low,moderate and high dosage kinetin group were intraperitoneally administrated with 5,10,20 mg/（kg·BW）of kinetin solutions once daily till 45thday;in the same period,the mice in aging model control group and young control group were subcutaneously administrated with saline on the back of the neck.At the end of the experiment,the spleen index of the mice in different groups was calculated,the activity of SOD,CAT,GSH-PX and the content of MDA in spleen were determined,and the serum content of IL-2,IL-6,IgA,IgG,IgM were evaluated.The results revealed that the spleen index of kinetin treatment groups was significantly or extremely significantly higher than that of aging model control group（P<0.05 or P<0.01）;the activity of the 3 tested antioxidant enzymes of kinetin treatment groups was increased in different degree compared with that of aging model control group,and the high dosage kinetin group exhibited extreme significance （P<0.01）;the content of MDA in spleen of kinetin treatment groups was significantly or extremely significantly reduced compared with that of aging model control group （P<0.05 or P<0.01）;the serum content of IL-2 of kinetin treatment groups was significantly or extremely significantly higher than that of aging model control group （P<0.05 or P<0.01),and the serum content of IL-6 was significantly or extremely significantly lower than that of aging model control group （P<0.05 or P<0.01）;the serum content of the 3 tested globulins of kinetin treatment groups was increased in different degree compared with that of aging model control group,and the high dosage kinetin group exhibited extreme significance （P<0.01）.Based on the results obtained in this study,it can be concluded that kinetin are capable to delay aging,resist oxidation damage and enhance immunity.

kinetin；aging；mice；spleen；immunity

R339.38；R392

A文章顺序编号1672-5190（2016）03-0018-04

2016－02－25

项目来源：河南科技大学大学生科研训练计划项目（SRTP项目，2015144）；河南科技大学实验技术开发基金项目（SY1516040）；河南科技大学教育教学改革项目（2015YB-017）；博士启动基金（4025/13480072）。

武莹莹（1997—），女，所学专业为动物医学。

李梦云（1974—），女，讲师，博士，主要研究方向为动物机能与形态、免疫及其生理调控。

（责任编辑：赵俊利）