马蓝与路边青的matK序列差异与分子鉴定方法分析

魏艺聪+陈建雄+黄泽豪+卢伟+梁一池

【摘 要】 目的：研究拟基于matK序列分析，探讨马蓝与路边青相互鉴别的新方法。方法：从GenBank核酸数据库下载马蓝与路边青matK 序列，应用ClustalX 2.1软件进行SNP鉴别位点分析，应用 MEGA5.0 软件计算种内和种间的（K2P）遗传距离，并构建邻接（NJ）系统聚类树。结果：获得8个马蓝matK序列及12个路边青matK序列，分析显示马蓝与路边青的matK序列具有近百个SNP位点，且其中多是马蓝与路边青特有的，可作为二者间相互鉴别的分子标记。且马蓝的最大种内 K2P 遗传距离0.001 与路边青最大种内 K2P 遗传距离0.005均远远小于马蓝与路边青的种间 K2P 遗传距离0.144～0.149，构建的系统发育树显示马蓝与路边青单独聚为一类。结论：matK序列可为马蓝与路边青的相互鉴别提供新的分子鉴定方法。

【关键词】 马蓝；路边青；matK序列；分子鉴别

【中图分类号】R282.5 【文献标志码】 A 【文章编号】1007-8517（2016）12-0027-03

Abstract：Objective To establish a new molecular method to authenticate Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum by using matK sequences in GenBank nucleicacid database. Methods Based on GenBank Nucleotide Database，matK sequences of Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum were downloaded. The SNP sites of them were checked by ClustalX 2.1 software ，K2P Distances were calculated using MEGA 5.0 software and neighbor-ioining（NJ） phylogenetic tree was established. Results There many specific SNP sites can be used to molecular identification of Centella asiatica and Baphicacanthus cusia. K2P genetic distance of intraspecific genetic distance of Baphicacanthus cusia is 0.001，and Baphicacanthus cusia is 0.005，which was far less than K2P genetic distance between Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum （0.144～0.149）. Results of NJ phylogenetic tree showed that Baphicacanthus cusia can be separated from Clerodendrum cyrtophyllum and classified into a separate one.Conclusions MatK sequence is suitable for molecular authentication n of Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum and provides reference for quality and safety identification of Baphicacanthus cusia and Clerodendrum cyrtophyllum .

Keywords：Baphicacanthus cusia； Clerodendrum cyrtophyllum； matK sequence； Identification

马蓝为爵床科植物马蓝Baphicacanthus cusia （Nees） Bremek.，根与叶入药，具有清热解毒、凉血消肿的功效，可用于预防流感、流脑，治疗腮腺炎、急性肠炎、咽喉炎、口腔炎、扁桃体炎、肝炎等炎症。路边青为马鞭草科植物大青 Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.，全草入药，具有祛风、除湿、止痛与镇痉等功效。在部分地区常习惯把两者当作中药“大青叶”使用，由于两者化学成分与功效主治均不相同[1-2]，因此在用药时应严格鉴别。但两者常分布于同一地区，干燥药材常因变形而不易鉴别，导致相互混淆。两者传统鉴别方法有：叶片显微鉴别法、TLC特征图谱鉴别法等[3-6]，但是方法均比较繁杂，急需一种简便、快速、可靠的鉴别方法。

近年来，DNA条形码分析技术为中药基源的分子鉴定提供了可靠的方法，已广泛应用于中药材的分子鉴定。其中，matK基因为单拷贝编码基因，序列长度约1500bp，位于叶绿体赖氨酸tRNA基因（trnK）高度保守的2个外显子之间的内含子中，编码参与RNA转录本中II型内含子剪切的成熟酶（maturase）。matK基因是叶绿体基因组中进化较快的基因之一，可在科、属级水平为研究类群内部的系统进化分析提供了较多的信息[7]。在某些类群中，matK序列也为种间、种下的系统进化研究提供了一定的价值[8]，在植物DNA条形码研究中被认为是的核心DNA条形码序列之一，matK基因也被用于药用植物的分子鉴定研究[9-11]。本研究应用matK条形码对易混品种马蓝与路边青进行鉴定分析，旨在为马蓝与其易混品路边青的快速准确鉴定及其准确应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 样本 从GenBank（美国国家生物技术信息中心（NCBI）建立的DNA序列数据库）下载马蓝（Baphicacanthus cusia（Nees ）Bremek.）与路边青（Clerodendrum cyrtophyllum Turcz.）的matK基因序列。其中，获不同来源的马蓝matK序列各8条，路边青matK序列各12条；样品采集信息及matK序列的GenBank登录号见表1。

1.2 序列处理 应用ClustalX 2.1软件对实验所获所有不同来源的matK序列进行多重对比，获得多重比对的matK序列，应用该序列进行SNP鉴别位点分析及后续遗传距离及系统聚类分析。

1.3 数据分析 利用MEGA5.0该软件对经过多重比对的受试序列进行种内种间Kimura 2-parameter （K2P）遗传距离分析，并构建邻接（NJ）系统聚类树。

2 结果

2.1 马蓝与路边青的matK序列中SNP位点分析 所获序列经ClustalX 2.1软件进行多重序列对比分析显示，其中8个不同来源的马蓝matK序列样本种内仅有1个SNP位点，而12个不同来源的路边青matK序列样本种内有6个SNP位点，而马蓝与路边青的matK序列之间的SNP位点多达近百个，其中多数SNP位点均属马蓝与路边青特异的，可作为马蓝与路边青相互鉴别的SNP位点。见图1。

2.2 马蓝与路边青的种内与种间的遗传距离分析 应用MEGA5.0 软件进行马蓝与路边青的种内与种间的Kimura2-parameter（K2P）遗传距离分析表明，8个受试马蓝样本matK序列的遗传距离为0～0.001之间，显示受试马蓝样本matK序列的种内变异极小。12个受试路边青matK序列的遗传距离为0～0.005之间，显示路边青matK序列的种内变异也很小。而马蓝与路边青的的种间遗传距离在0.144～0.149之间，结果表明受试马蓝与路边青的的种间遗传距离远大于受试马蓝与路边青的的种内遗传距离。因此，matK序列能够将马蓝与路边青区分开，该序列可用于鉴别条形码。

2.3 马蓝与路边青的系统聚类树鉴定分析 所获所有样本序列应用Meg 5.0软件构建NJ系统聚类树进行分析，进一步分析其相互近源关系，见图2。NJ系统聚类树结果显示8个不同来源的马蓝样本与12个不同源的路边青样本分别单独聚为一类，二者之间没有交叉。以上结果表明，matK序列适用于马蓝与路边青之间的鉴别，可作为马蓝与路边青之间相互鉴别的提供分子鉴定依据。

3 小结

对马蓝与路边青之间的传统鉴别方法主要有叶片显微结构和化学成分差异等方面[1-2]。何报作等[3]应用LMVP（叶形态-脉序图谱鉴别法与QAERM）定量分析评价法对马蓝与路边青进行相互鉴别；覃继佳等[4]采用显微鉴别法马蓝叶与混淆品路边青叶的脉末梢显微鉴别特进行鉴别。而通过化学成分差异分析进行鉴别的研究有，黄燮才等[5]提出用 TLC 区别马蓝叶与其同属植物的易混淆品；薛漓等[6]提出鉴别路边青叶的TLC特征图谱、重现性较好。随着DNA 条形码技术易于形成统一的操作标准，可靠性与稳定性高，已经被广泛应用中药材的鉴定[9-11]。本研究对马蓝与路边青的绿体DNA中matK基因序列分析，结果显示，马蓝与路边青的matK序列具有丰富的SNP位点，且其中多是马蓝与路边青特有，可用于相互鉴别的分子标记。且马蓝最大种内 K2P 遗传距离 0.001 远远小于马蓝与路边青的种间 K2P 遗传距离 0.144～0.149，构建的系统发育树显示马蓝与路边青之间没有交叉，分别聚为单独一类。结果均显示，matK序列作为 DNA 条形码的可为准确、简便地鉴定马蓝与路边青相互鉴别提供新的分子鉴定方法。

参考文献

[1] 国家中医药管理局，《中华本草》 编委会. 中华本草（第七册）[M].上海：上海科学技术出版社， 1999： 450-451.

[2] 国家中医药管理局，《中华本草》 编委会. 中华本草（第六册） [M].上海：上海科学技术出版社， 1999： 566-567.

[3] 何报作，覃继佳，朱意麟，等. 马蓝叶与其易淆品路边青叶的叶形态-脉序图谱的鉴别特征[J].中药材，2012，35（3）：385-391.

[4] 覃继佳，何报作.马蓝叶与混淆品路边青叶的脉末梢显微鉴别特征[J].广西中医药，2011，34（6）：55-57.

[5] 黄燮才，杨芬，韦家福.中药马蓝叶及其混乱品的比较鉴别[J].广西植物，1988， 8（3）：239-243.

[6] 薛漓，饶伟文. 路边青的鉴别研究[J].中草药，2004，35（4）：455-457.

[7] Plunkett， G.， D. Soltis， and P. Soltis， Clarification of the relationship beteen Apiaceae and Araliaceae based on matK and rbcLsequence data[J]. American Journal of Botany， 1997，84（4）：565-565.

[8] Stanford A M， Harden R， Parks C R. Phylogeny and biogeographyof Juglans （Juglandaceae） based on matK and ITS sequence data[J].Am J Bot， 2000， 87（6）： 872-882.

[9] 刘静，何涛，淳泽.药用石斛的叶绿体 matK 基因序列分析及鉴别[J].药学学报， 2009， 44（9） ：1051-1055.

[10]陈士林，宋经元，姚辉，等.药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J].中国天然药物，2009，7（5）322-327.

[11]陈士林，姚辉，宋经元，等.基于DNA barcode （ 条形码）技术的中药材鉴定[J].世界科学技术-中医药现代化，2007，9（3）：7-12.

（收稿日期：2016.04.15）