蜂蜡黄酮抑菌性实验研究

◎蔡晓东，张甑妮，闵莉静

（1.湖州师范学院求真学院，浙江 湖州 313000；

2.湖州师范学院生命科学学院，浙江 湖州 313000）

蜂蜡黄酮抑菌性实验研究

◎蔡晓东1，张甑妮1，闵莉静2

（1.湖州师范学院求真学院，浙江 湖州 313000；

2.湖州师范学院生命科学学院，浙江 湖州 313000）

通过从蜂蜡中提取黄酮类化合物，探究其抑菌活性，测定其对不同菌种的最低抑菌浓度及其抑菌活性的影响因素，旨在为蜂蜡的推广利用提供依据。

蜂蜡；黄酮；抑菌活性

蜂蜡，又称黄蜡、蜜蜡。蜂蜡中含有一定的黄酮类化合物，具有一定抑菌活性。基于此，讨论蜂蜡黄酮的抑菌活性及其影响因素。

1　材料与方法

1.1材料

蜂蜡，豆芽，葡萄糖，琼脂，蔗糖，NaNO3，K2HPO4，KCl，MgSO4，FeSO4。

1.2方法

1.2.1蜂蜡黄酮的制备

蜂蜡若干，干燥，粉碎，称取粉末，加入乙醇，加热提取，搅拌，抽滤，取滤液，重复操作2次，减压浓缩，正己烷水溶液萃取，除脂，备用[1]。

1.2.2培养基的制备

豆芽汁培养基（酵母菌用）的成分见表1；

察氏培养基（霉菌用）的成分见表2；

琼脂培养基（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌用）的成分见表3[2]。

表1　豆芽汁培养基的成分表

表2　察氏培养基的成分表

表3　琼脂培养基的成分表

1.2.3菌株活化及菌悬液的制备

（1）供试菌株的活化。用接种环挑取各种菌种，分别在斜面培养基上划线，将金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌培养基置于36±1 ℃烘箱培养18～24 h；黑曲霉菌在28±1 ℃烘箱培养48 h；酵母菌置于30±1 ℃烘箱培养24 h，观察菌株生长情况，生长良好后，4 ℃保藏备用。

（2）供试菌株的菌悬液制备。分别挑取适量的活化后金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、黑曲霉菌和酵母菌体，分别接入无菌水中，摇匀，制成孢子、菌体悬浮液。

1.2.4滤纸片扩散法测定蜂蜡黄酮的抑菌效果：

将定性滤纸剪成直径6 m m的小圆片，放于干燥培养皿中，50张/皿，灭菌，再分别在蜂蜡黄酮提取液、60%乙醇、75%乙醇，无菌水中浸泡24 h。分别吸取0.2 m L各菌种菌悬液涂布在各自培养基上，分别夹取上述制备的浸泡各种液体的无菌滤纸片，甩去多余液体，覆在涂布各种菌种的平皿上，4片/皿，不同培养温度下培养。2次平行实验。量取滤纸片的抑菌圈大小，比较抑菌效果。

1.2.5蜂蜡黄酮的最低抑菌浓度（MIC）的测定

在无菌条件下，把蜂蜡黄酮提取物配制成浓度为100%、50%、25%、12.5%、6.25%、3.125%和1.56%的一系列不同浓度的溶液。分别移取2 mL上述系列浓度溶液至15 mL培养基中，加入200 μ L各种不同菌种的活化菌液，摇匀，各自培养温度下培养24 h后，观察菌落生长状况。菌落被完全抑制的最高稀释度的提取物浓度即为该菌种的最低抑菌浓度（MIC）。

1.2.6蜂蜡黄酮抑菌活性的外界影响因素研究

（1）培养基酸碱度对蜂蜡黄酮抑菌效果的影响。用0.1 mol/mL HCl或NaOH溶液调节培养基酸碱度，分别达到琼脂培养基pH值为4、5、6、7、8和9。然后，用各菌相应的最低抑菌浓度下的稀释液进行抑菌试验，空白对照。讨论培养基酸碱度对蜂蜡黄酮抑菌活性的影响。

（2）温度对蜂蜡黄酮抑菌效果的影响。分别移取5 mL各菌相应的最低抑菌浓度下的稀释液于自然酸碱度的琼脂培养基中，于40、60、80、100 ℃和121 ℃的水浴培养2 h，空白对照。讨论培养温度对蜂蜡黄酮抑菌活性的影响。

（3）共培养时间对蜂蜡黄酮抑菌效果的影响

选以大肠杆菌作为代表菌种，设定共培养时间分别为1、3、6、9 h和12 h，空白对照，讨论提取物与菌种共培养时间对蜂蜡黄酮抑菌活性的影响。

2　结果与讨论

蜂蜡黄酮对试验菌的抑菌效果见表4，对供试菌种最低抑菌浓度的测定结果见表5，不同的pH值、不同的温度、共培养时间对蜂蜡黄酮提取物抑菌活性的影响结果分别见表6、7、8。

表4　蜂蜡黄酮对试验菌的抑菌效果表

表5　蜂蜡黄酮对供试菌种最低抑菌浓度的测定结果表

表6　不同的pH值对蜂蜡黄酮提取物抑菌活性的影响表

表7　不同的温度对蜂蜡黄酮提取物抑菌活性的影响表

表8　共培养时间对蜂蜡黄酮提取物抑菌活性的影响表

由表4～8的结果表明，蜂蜡黄酮提取物对金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌、大肠杆菌和黑曲霉菌均有不同程度的抑制作用，其最低抑菌浓度浓度（MIC）分别为6.25%、3.125%、3.125%、 3.125%、6.25%和3.125%。

3　结论

蜂蜡黄酮抑菌活性影响因素实验表明，低pH值、低温、长共培养时间有利于其发挥抑菌性。

[1]郭孝武.一种提取中草药化学成分的方法--超声提取法[J].天然产物研究与开发，2010，11（3）：37-40.

[2]曾超珍，刘志祥，韩磊.黄芩总黄酮提取技术及其抑菌活性研究[J].时珍国医国药2009，20（6）：1342-1343.

Study on the Antibacterial Activity of Flavonoids from Beeswax

Cai Xiaodong1， Zhang Zengni1， Min Lijing2
（1.Qiuzhen School of Huzhou University， Huzhou 313000， China；
2.Life Science School of Huzhou University， Huzhou 313000， China）

In this paper， we extracted flavonoids from beeswax and discussed on their antibacterial activity. Then we determined the minimal inhibitory concentration （MIC） and the factors affecting the antimicrobial activity， in order to provide reference for the popularization and utilization of beeswax.

Beeswax； Flavonoids； Antibacterial activity

TQ28

10.16736/j.cnki.cn41-1434/ts.2016.08.026

由2016年度湖州师范学院大学生创新创业训练计划项目资助。

指导老师：闵莉静（1981-），女， 硕士，实验师；主要研究方向为天然产物。