响应面法优化重组运动发酵单胞菌极高密度乙醇发酵工艺

曹尚志,黄乐滔,罗　娟,上官敏敏,邓　颖,汪浩勇

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,湖北武汉 430068)



响应面法优化重组运动发酵单胞菌极高密度乙醇发酵工艺

曹尚志,黄乐滔,罗娟,上官敏敏,邓颖,汪浩勇*

(湖北工业大学发酵工程教育部重点实验室,湖北武汉 430068)

采用基因工程技术,成功地构建了在无需氨基酸和维生素的条件下,能高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖发酵生成乙醇的重组菌Z.mobilisHYMX。为了提高发酵乙醇产量,利用响应面法优化了重组菌极高密度发酵的工艺条件。结果表明,最佳发酵条件为:葡萄糖浓度305 g/L,温度34 ℃,pH6.5,尿素浓度3 g/L,接种量10%,发酵时间60 h。在此条件下重组单胞菌的乙醇产量达到153.1 g/L,比优化前提高了8.5%,比原型菌产量提高了105.14%。与工业酵母菌株PE-2相比重组菌节省了约12%的葡萄糖,节省了37.5%的时间。

重组运动发酵单胞菌,响应面法,发酵条件,乙醇产量

当今世界能源问题、环境问题日益严峻,对燃料乙醇的应用与发展的研究,不仅能为当代的生物能源开发利用提供借鉴,同时还可以缓解全球性的能源危机,减少传统能源引起的环境问题[1]。能源危机促使乙醇发酵菌种的研究,用低成本产生最大化的乙醇以满足日益增长的需要。酵母菌株PE-2是文献报道最终乙醇产量最高的乙醇发酵菌种。30%的巴西乙醇工厂采用酵母菌株PE-2,全世界超过10%的乙醇来自酵母菌株PE-2发酵。Pereira FB,Guimaraes PMR等人用重组酵母菌株PE-2在葡萄糖浓度为343 g/L,发酵96 h条件下得到乙醇产量为151 g/L[2]。

运动发酵单胞菌(Z.mobilis)被认为是进行乙醇生产最合适的细菌之一,是良好的燃料乙醇生产菌种[3]。与其它微生物相比,该菌代谢途径相对简单,通过2-酮-3脱氧-6磷酸葡萄酸(ED)途径高效专一代谢葡萄糖、果糖生产乙醇[4]。本文用Tn5转座技术,向Z.mobilis基因组整合了13个基因(xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB、metB、yfdZ、FAR、WS/DGAT、TesA),构建出重组菌Z.mobilisHYMX。

响应面分析法[5-7]可以进行实验组合设计,其在实验室和现实工厂生产研发中应用广泛。为了使重组菌乙醇产量最大化,利用响应面分析法对重组菌高浓度葡萄糖的发酵工艺条件进行优化,对后续的高糖浓度发酵生产乙醇以及工业化研究具有指导意义。

表1　PB实验水平

1　材料与方法

1.1材料与仪器

运动发酵单胞菌(Z.mobilis)来自ATCC31821;大肠杆菌(E.coliK12)由作者实验室保藏;重组运动发酵单胞菌(Z.mobilisHYMX)本次构建;Pfu DNA聚合酶购自NEB公司;T4 DNA 接酶和各种限制性内切酶购自大连宝生物公司;质粒小量抽提试剂盒和胶回收试剂盒购自长沙安比奥生物技术公司;酵母粉购自安琪酵母有限公司;葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、尿素及其余试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司。

My cycle型PCR仪美国Bio-rad;Micro Pulser型电转化仪美国Bio-rad;UV-2000型分光光度计上海尤尼柯仪器有限公司;GC7890F气相色谱仪上海天美科学仪器有限公司;DYY7C电泳仪北京六一仪器;IMS-20全自动制冰机常熟学科电器有限公司;DNP-9052电热恒温培养箱上海精宏科学仪器厂;Tanon-2500凝胶成像系统上海天能科技有限公司;GC7890F气相色谱仪上海天美科学仪器有限公司。

1.2培养基

种子与活化培养基:100 g/L葡萄糖,10 g/L酵母提取物,1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氢钾,0.5 g/L七水硫酸镁,调节至pH6.0,115 ℃灭菌30 min。

基础发酵培养基:290 g/L葡萄糖,10 g/L酵母提取物,1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氢钾,0.5 g/L七水硫酸镁,调节至pH6.0,115 ℃灭菌30 min。厌氧条件下32 ℃发酵60 h。

无氨基酸和维生素培养基:不同质量浓度的还原糖(葡萄糖、木糖、甘露糖、阿拉伯糖),1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氢钾,0.5 g/L七水硫酸镁,调节至pH6.0,115 ℃灭菌30 min。厌氧条件下32 ℃发酵60 h。

1.3实验方法

1.3.1重组菌Z.mobilisHYMX构建方法利用PCR重叠技术,将各个功能基因序列融合,构建出需要的转座子。然后将克隆的转座子连接到运动发酵单胞菌转座载体上,最后将连接好的转座载体转座到Z.mobilis基因组上得到重组菌Z.mobilisHYMX[8]。

1.3.2重组菌还原糖利用及无氨基酸和维生素条件下的发酵验证无氨基酸和维生素培养基成分如下:葡萄糖(100、140、180 g/L)、1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氢钾,0.5 g/L七水硫酸镁,pH6.0。10%接种量,厌氧条件下32 ℃静置发酵60 h。

配制还原糖无氨基酸和维生素培养基成分如下:60 g/L(木糖、阿拉伯糖、甘露糖),1 g/L尿素,1 g/L磷酸二氢钾,0.5 g/L七水硫酸镁,pH6.0。10%接种量,厌氧条件下32 ℃静置发酵60 h。

1.3.3单因素实验对影响运动发酵单胞菌基因工程菌发酵产乙醇的几个因素做单因素实验,主要有温度、发酵时间、初始pH、初始葡萄糖浓度、接种量、尿素浓度。

选取5个温度梯度:28、32、34、36、40 ℃,接种量10%,葡萄糖浓度290 g/L,尿素浓度1 g/L,pH6,发酵60 h;5个时间梯度:40、50、60、70、80 h,接种量10%,葡萄糖浓度290 g/L,温度32 ℃,尿素浓度1 g/L,pH6;5个初始pH4、5、6、7、8,接种量10%,葡萄糖浓度290 g/L,温度32 ℃,尿素浓度1 g/L,发酵60 h;5种初始葡萄糖浓度:270、280、290、300、310 g/L,接种量10%,温度32 ℃,尿素浓度1 g/L,pH6,发酵60 h;5种接种量:5%、8%、10%、12%、15%(V/V),葡萄糖浓度290 g/L,温度32 ℃,尿素浓度1 g/L,pH6,发酵60 h;5种尿素浓度:1、2、3、4、5 g/L,接种量10%,葡萄糖浓度290 g/L,温度32 ℃,pH6,发酵60 h。

各种条件下培养基中还需加入10 g/L酵母提取物,1 g/L磷酸二氢钾,0.5 g/L七水硫酸镁,厌氧静置发酵。

1.3.4Plackett-Burman实验根据单因素实验结果,分别为葡萄糖浓度(g/L)、初始pH、发酵温度(℃)、发酵时间(h)、接种量(℃)、尿素浓度(℃);每个因素分别取高(1)、低(-1)两个水平,应用Design-Expert8.0进行实验设计和分析,以乙醇产量为响应值,共进行12组实验，实验设计见表1。

1.3.5爬坡实验根据Plackett-Burman实验,设计爬坡实验,找到逼近最大响应值的区域。

1.3.6中心组合(CCD)实验方法根据最陡爬坡实验结果,显著因素以中心点为零水平,用Design Expert 8.0软件设计中心组合实验并进行响应面分析，实验设计见表2。

表2　CCD实验水平

1.3.7乙醇测定的方法乙醇产量采用气相色谱仪测定,计算方法为内标法,以正丁醇为内标物[9-10]。

2　结果与分析

2.1重组菌构建与初筛

本实验以多种不同种属来源细菌的基因组为模板,首先分别克隆了xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB、metB、yfdZ、FAR、WS/DGAT和TesA,经过测序确认DNA序列无误后,构建其能在Z.mobilis中表达的操纵子。将13个操纵子按图1的顺序连接成一个连续的DNA分子,构建Tn5转座载体。其中,xylA、xylB、araB、araA、araD、manA、tktA、talB操纵子[11-12],使细菌获得利用木糖、阿拉伯糖、甘露糖的能力。metB、yfdZ操纵子[13]使细菌可以在无氨基酸和维生素的培养基中生长和发酵生产乙醇。由于有文献报道乙醇耐受细菌体内的脂肪酸含量明显增加,构建了TesA、FAR和WS/DGAT[14-15]操纵子,用于增加细菌体内脂肪酸的含量。

实验中将如图1所示的Tn5转座子整合到Z.mobilis的基因组上。取转座载体10 μL与5 μL的Tn5转座酶混合,37 ℃水浴2 h,取3 μL与Z.mobilisCP4感受态细胞混合,电击后用种子培养基32 ℃培养4～6 h[16]。

将培养后的重组运动发酵单胞菌的菌液离心去上清,用无菌生理盐水稀释,涂板到30 g/L木糖、30 g/L阿拉伯糖或30 g/L甘露糖为唯一碳源的固体平板中培养。将PCR鉴定正确的阳性转座子,加入等体积的40%灭菌甘油,放在-80 ℃冰箱保存。

图1　转座子的示意图Fig.1　Schematic diagram of transposon

2.2重组菌还原糖利用及不添加氨基酸和维生素发酵验证

由表3可知重组菌在三种葡萄糖浓度的无氨基酸和微生物培养基中发酵产量达到了50、69.5、88.5 g/L。说明重组菌可以在无氨基酸和无维生素培养基中高效发酵葡萄糖生产乙醇。

表3　无氨基酸和维生素的发酵验证结果

由表4可知最终乙醇产量分别为20.5、18.2、24.3 g/L,说明重组菌可以很好的利用葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖生产乙醇。

表4　重组菌还原糖发酵验证结果

2.3单因素实验

2.3.1温度对乙醇产量的影响不同温度对乙醇产量的影响结果如图2所示,开始时随着温度的提高,乙醇产量提高明显,在32 ℃和34 ℃时乙醇产量分别为141.3 g/L和141.5 g/L。随着温度的进一步提高到36 ℃时,乙醇产量下降到129.6 g/L,下降了8.5%。当温度达到40 ℃时,乙醇产量只有112.8 g/L,所以选取32 ℃是最合适的温度,温度继续提高不仅不能提高乙醇产量还会提高成本消耗更多能量。

1.3 排除标准 ⑴20岁以下的AECOPD患者；⑵合并自身免疫性疾病、恶性肿瘤等终末期疾病、严重代谢性疾病、严重肝肾功能障碍的患者；⑶非实施本病综合救治原因死亡的患者。

图2　温度对乙醇产量的影响Fig.2　Effect of temperature on ethanol yield

2.3.2发酵时间对乙醇产量的影响不同发酵时间对乙醇产量的影响结果如图3所示,随着发酵时间的增加乙醇产量在增加,在70 h达到最大值145.4 g/L,发酵时间80 h时,乙醇产量有所下降,只有141.9 g/L,但是在发酵时间60 h时乙醇产量141.5 g/L与70 h相比乙醇产量相差较小,综合考虑能耗成本等因素,选择60 h为最合适发酵时间。

图3　发酵时间对乙醇产量的影响Fig.3　Effect of fermentation time on ethanol yield

2.3.3初始pH对乙醇产量的影响不同初始pH对乙醇产量的影响结果如图4所示,开始时pH的增大使乙醇产量增加,在pH6.0时乙醇产量最高为141.3 g/L。pH再增大,乙醇产量开始下降,所以pH6.0是最合适的发酵初始pH。

图4　初始pH对乙醇产量的影响Fig.4　Effect of initial pH on ethanol yield

2.3.4葡萄糖浓度对乙醇产量的影响不同葡萄糖浓度对乙醇产量的影响如图5所示,随着葡萄糖浓度的增加乙醇产量在提高,在300 g/L时产量最高为145.3 g/L,但是在葡萄糖浓度达到310 g/L时,乙醇产量下降明显,所以300 g/L的葡萄糖浓度为合适的发酵浓度。

图5　葡萄糖浓度对乙醇产量的影响Fig.5　Effect of glucose concentration on ethanol yield

2.3.5接种量对乙醇产量的影响不同接种量对乙醇产量影响如图6所示,开始随着接种量的增加,乙醇产量增加明显,在10%接种量时产量达到最高为141.3 g/L。随着接种量的增加,乙醇产量反而下降,所以10%接种量最合适。

图6　接种量对乙醇产量的影响Fig.6　Effect of inoculation amount on ethanol yield

2.3.6尿素浓度对乙醇产量的影响不同尿素对乙醇产量影响如图7所示,可以看到尿素对乙醇产量的影响较小,而尿素浓度在3 g/L时乙醇产量最高为合适浓度,此时产量最高为142.8 g/L。

图7　尿素浓度对乙醇产量影响Fig.7　Effect of urea concentration on ethanol yield

2.4Plackett-Burman实验结果分析

PB实验设计及结果见表5,各因素显著性水平分析见表6。根据表6数据可知,模型p值<0.0001,说明该模型非常显著可信度高。A、C、D的p值均<0.01表明A、C、D因素极显著。因此,温度、初始pH及葡萄糖浓度对乙醇产量R影响极显著,而且由表6可知这三个因素对乙醇产量的总贡献值达到98%以上,因此在后续实验中主要考虑这三个因素。

表5　Plackett-Burman实验设计及结果

注:G、H、I、J、K、L表示虚拟因素。

2.5最陡爬坡实验结果与分析

根据表6结果可知温度、初始pH均为负效应,葡萄糖浓度为正效应,设计爬坡实验方案及结果如表7。由表7可知第四组实验最接近最佳值区域,即葡萄糖浓度为300 g/L,温度为31 ℃,pH为6.5时乙醇产量达到最高为147.8 g/L。

表7　最陡爬坡实验设计与结果

2.6响应面实验设计及结果

由最陡爬坡实验确定了最重要影响因素的取值区域。利用Design Expert软件设计进行CCD实验设计及结果见表8,以X1、X2、X3、Y分别表示葡萄糖浓度、温度、pH、乙醇产量。

表6　Plackett-Burman实验结果方差分析

表9　CCD实验结果方差分析

表8　CCD实验设计及结果

2.7响应面图、最适发酵条件的确定及验证实验

根据上述的回归方程用Design Expert绘出响应面分析图8。等高线可以反映各因素的交互作用,响应面越陡说明交互作用越明显,由图8可知,这三个因素交互作用不显著,响应面图都是接近圆形而非陡峭的椭圆形。由响应图可知该抛物线图形均开口向下,说明方程确实存在最大值,对上述二次多项回归模型方程逐步回归,以及通过表8、表9得到发酵乙醇的最佳条件为温度34 ℃,葡萄糖浓度为305 g/L,pH6.5,在此条件下进行验证实验,重复实验6次,平均值为153.1 g/L。

图8　葡萄糖浓度、温度、pH交互作用对乙醇产量影响的响应面图Fig.8　Response surface plots of effect of interaction between glucose concentration,temperature and pH on ethanol yield

3　结论

成功的构建了不需要添加氨基酸和维生素,能同时高效利用葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和甘露糖生成乙醇的基因重组菌Z.mobilisHYMX。解决了运动发酵单胞菌利用碳源单一的缺点,为细菌低成本生产乙醇打好基础。

运用响应面分析法对基因重组菌Z.mobilisHYMX极高密度乙醇发酵工艺条件进行优化。确定了最佳发酵条件为葡萄糖浓度305 g/L,温度34 ℃,pH6.5,尿素浓度3 g/L,接种量10%,发酵时间60 h。在此条件下经过6次重复实验得到平均153.1 g/L的乙醇产量,比优化前提高了8.5%,比原型菌产量提高了105.14%。与工业酵母菌株PE-2相比重组菌节省了约12%的葡萄糖,节省了37.5%的时间。

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Optimization of very high ethanol fermentation conditions of the recombinantZymomonasmobilisby response surface method

CAO Shang-zhi,HUANG Le-tao,LUO Juan,SHANG-GUAN Min-min,DENG Ying,WANG Hao-yong*

(Key Laboratory of Fermentation Engineering Ministry of Education,Hubei University of Technology,Wuhan 430068,China)

The recombinant bacteriaZ.mobilisHYMX which can utilize glucose,xylose,arabinose and mannose to produce ethanol in the culture medium without amino acids and vitamins,was constructed by genetic engineering technology. The fermentation conditions of the HYMX strain under very high gravity ethanol fermentation conditions were optimized by the response surface methodology. The results showed that the optimum conditions were:glucose concentration 305 g/L,temperature 34 ℃,pH6.5,urea concentration 3 g/L,inoculation amount 10%,fermentation time 60 h. Under the optimized conditions,the ethanol yield of the recombinant strain was 153.1 g/L,8.5% higher than the non-optimized one,105.14% higher than the prototype strain. Compared with the industrial yeast strain PE-2,the glucose saving was more than 12%,and the fermentation time saving was more than 37.5%.

recombinantZymomonasmobilis;response surface method;fermentation conditions;the ethanol yield

2016-01-18

曹尚志(1987-)，男，硕士研究生，研究方向：生化与分子生物学，E-mail:cao.shang.zhi@qq.com。

汪浩勇(1969-)，男，博士，教授，研究方向：生化与分子生物学，E-mail:haoyongw@qq.com。

湖北省优秀中青年团队计划项目(T200705)。

TS201.3

B

1002-0306(2016)16-0184-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.028