山蓝红色素的微波提取工艺及抑菌活性

张贞发,翁艳英,彭金云,黄孙娟,农克良,2,*

(1.广西民族师范学院化学与生物工程系,桂西南特色植物资源化学广西高校重点实验室培育基地,广西崇左 532200;2.广西教育学院,广西南宁 530023)



山蓝红色素的微波提取工艺及抑菌活性

张贞发1,翁艳英1,彭金云1,黄孙娟1,农克良1,2,*

(1.广西民族师范学院化学与生物工程系,桂西南特色植物资源化学广西高校重点实验室培育基地,广西崇左 532200;2.广西教育学院,广西南宁 530023)

以植物山蓝为原料,采用水溶剂微波辅助提取红色素。通过单因素实验和正交实验优化提取工艺,并经过柱层析初步纯化红色素部分进行抑菌实验。结果表明:微波功率300 W,料液比1∶40(m/V),提取温度60 ℃,提取时间9 min为山蓝红色素微波提取的最佳工艺条件,提取率为0.323%;提取得到的山蓝红色素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌有抑制作用,最小抑菌浓度分别为500、400、700、500 mg·L-1。

红色素,微波提取,抑菌活性

山蓝又名紫蓝、红兰、红丝线、红蓝草,为爵床科山蓝属植物的全草,味微甘淡、气香、性凉,具有化瘀、止血、止咳、化痰、解毒、消炎等功效[1-3],茎近似圆柱形,略有弯曲,易断。山蓝提取液为红色,天然红色素具有抗氧化、抗癌、抗衰老等保健作用[4],一些少数民族用山蓝汁液着色食品。目前对山蓝的研究主要集中在化学成分[1,5]、黄酮提取[6-7]、多糖提取[8]、红丝线素提取[9]和色素提取[10-11]等方面。此外,还有一些其它植物红色素提取及其抑菌活性的报道[12-15]可供参考。这些有关红色素提取工艺研究的报道,均以红色素溶液的吸光度为指标,由于没有采用对照品,无法计算红色素的提取率。本实验采用羟基红花黄色素A为红色素的对照品,采用分光光度法检测其含量,计算红色素的提取率,得到最佳提取工艺和红色素的提取率,并对提取的红色素进行初步纯化,探讨抑菌效果,对充分利用山蓝这种可再生植物资源制作民族特色食品有重要意义。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

山蓝购自广西崇左市江南市场,去离子水洗净,60 ℃烘干,粉碎,过40目筛,冷藏备用;羟基红花黄色素A(红色素测定对照品)中国食品药品检定研究院(ID:DSQA-BZ4H);石油醚(bp 60～90 ℃)、乙酸乙酯、氯化钠、氢氧化钠、盐酸均为分析纯,购自成都市科龙化工试剂厂;胰蛋白胨、琼脂、柱层析硅胶购自国药集团化学试剂有限公司;大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌购自北京北纳凯创生物技术有限公司;牛肉膏蛋白胨培养基蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、氯化钠5 g、去离子水1000 mL、pH7.0～7.2,高压蒸汽灭菌备用;实验用水为实验室自制去离子水。

XH-200A型电脑微波固液相合成/萃取仪北京祥鹄科技发展有限公司;UV-6100S型紫外可见分光光度计上海元析仪器有限公司;AR124CN型电子分析天平奥豪斯仪器有限公司;LDZM-60KCS型立式高压蒸汽灭菌器上海申安医疗器械有限公司;DGX-9053B-1型电热恒温鼓风干燥箱上海福玛实验设备有限公司;RHP-600A型不锈钢中药粉碎机浙江荣浩工贸有限公司。

1.2实验方法

1.2.1色素的提取准确称取已粉碎过40目筛的山蓝粉末1 g,置于100 mL圆底烧瓶中,按设计的料液比加入去离子水,置于电脑微波固液相合成/萃取仪中提取,过滤,定容。

1.2.2色素的检测以去离子水为溶剂,配制浓度为4 mg·L-1羟基红花黄色素A水溶液,用紫外可见分光光度计在200～800 nm范围内全波长扫描,最大吸收波长为405 nm。在405 nm波长下检测吸光度,制作标准曲线。

以去离子水做参比,405 nm作为测定波长,测定在不同条件下提取出的山蓝红色素的吸光度,根据标准曲线求算浓度,根据下列公式计算红色素的提取率。

红色素的提取率(%)=所称样品中提取的红色素的量/称样量×100

1.2.3单因素实验设计以红色素(以羟基红花黄色素A为对照)的提取率为指标,固定称样量为1 g,微波功率150 W,料液比为1∶40(m/V),提取温度为50 ℃,提取时间为6 min,依次改变微波功率(150、300、450、600、750 W),料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50 m/V),提取温度(40、50、60、70、80 ℃),提取时间(3、6、9、12、15 min),考察微波功率、料液比、温度和时间对色素提取得率的影响。

1.2.4正交实验设计根据单因素实验结果,选取微波功率、料液比、温度和时间的较优水平,进行L9(34)正交实验,优化山蓝红色素的提取工艺。正交实验因素水平见表1。

表1　因素水平表

1.2.5分离纯化将提取出的山蓝色素在40 ℃下旋转蒸发至干,得到浸膏。采用200～300目硅胶层析柱进行纯化分离[5],洗脱剂为乙酸乙酯和石油醚(体积比1∶1),主要得到淡绿色、红黄色和不被洗脱的深褐色三部分,收集红黄色部分溶液。

1.2.6抑菌实验采用牛肉膏蛋白胨培养基,彻底灭菌。将山蓝提取物柱层析分离后的红黄色部分的溶液收集,旋转蒸发至干,配制成含浸膏质量浓度分别为100～1000 mg·L-1的溶液,灭菌备用,同时以无菌水做空白对照。

用打孔器将滤纸制成直径为6 mm的圆形滤纸片,并在121 ℃、0.103 MPa蒸汽灭菌20 min,分别浸泡到浸膏溶液中6～8 h。将制好的培养基平板,均匀的涂抹上实验用到的四种菌(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌)。含菌平板的滤纸片按图1所示摆放。顺时针为梯度从低到高,中间为空白对照。将有滤纸片的培养皿放置37 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察细菌的生长情况,使用游标卡尺测量抑菌圈的大小,并记录。

图1　含菌培养皿中滤纸片的放置Fig.1　Paper with bacterium in the culture dish

1.2.7最小抑菌浓度的测定将柱层析初步纯化后的红黄色部分溶液配制成含浸膏浓度分别为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000 mg·L-1的溶液,测定对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度,以无菌水替代浸膏溶液作空白对照。放入37 ℃培养箱中恒温培养24 h后,以培养皿中完全无菌生长的最低浓度作为相应的样品对相应菌的最小抑菌浓度。

1.3数据处理

单因素实验均取3次平行实验的平均值进行分析,用Excel作图并进行分析处理,结果以平均值±标准差表示。

2　结果与讨论

2.1单因素实验

2.1.1微波功率对红色素提取结果的影响实验结果如图2所示,随着微波功率从150 W增加到750 W,提取率呈现出先变大后减小的趋势。当微波功率从150 W增大时,加热效率提高,加热速度也加快,水溶性的红色素就更容易从植物体内溶出,当功率达到450 W时,提取率达到0.287%,继续增大功率,提取率并不上升,说明提取接近完成,或红色素在微波功率太高的情况下发生了分解变质,也有可能是微波辐射的能量相对提取体系吸收等能量过剩,超过了提取体系所能吸收微波的最大量。

图2　微波功率对红色素提取结果的影响Fig.2　Effect of microwave power on the extraction results

2.1.2料液比对红色素提取结果的影响料液比对红色素的提取率随着提取剂用量的增加而增加。料液比对红色素提取效果的影响如图3所示,当料液比大于1∶30(m/V)时,吸光度值增加趋势变缓甚至不变。说明红色素基本被提取完全,继续增加提取剂用量对提取效果影响不大,并且会增大旋转蒸发是溶剂的回收量,增加了能耗。

图3　料液比对红色素提取结果的影响Fig.3　Effect of material liquid ratio on the on the extraction results

2.1.3提取温度对红色素提取结果的影响提取温度对红色素提取结果的影响如图4所示,随着提取温度的升高,提取率逐渐增大,当温度超过60 ℃时,提取率反而开始下降。温度从30 ℃升高至60 ℃时,热运动剧烈,溶解出的红色素越多,提取率升高,但是当温度继续升高会对红色素产生破坏,因此提取率降低。

图4　提取温度对红色素提取结果的影响Fig.4　Effect of temperature on the extraction results

2.1.4提取时间对红色素提取结果的影响提取时间对提取效果的影响如图5所示,随着提取时间增大,红色素的提取率先是大幅度升高,然后逐渐呈现不同幅度的下降。推测原因可能是时间过短时,红色素还没能充分溶解出,当提取一定时间后,红色素的扩散速度逐渐变慢直至两相间的浓度平衡,提取基本完成,如果继续延长提取时间可能会使红色素在提取温度下遭到破坏或其他成分部分溶出产生影响等,导致提取率降低。

图5　提取时间对红色素提取结果的影响Fig.5　Effect of time on the extraction results

2.2正交实验

在提取山蓝红色素中,四种因素对提取结果的影响程度依次为D>B>C>A,即提取时间>提取温度>料液比>微波功率。提取山蓝红色素的最佳工艺条件为A1B2C3D3,即微波功率为300 W,料液比为1∶40(m/V),提取温度为60 ℃,提取时间为9 min。

表2　正交实验结果

以最佳提取条件为实验条件实验3次,得到的提取率分别为0.323%、0.324%、0.323%,平均值为0.323%,标准差为0.05%。结果表明微波辅助提取山蓝红色素的实验重现性较好,而且3次实验结果的平均值高于正交实验中其他9次实验的提取率,因此确定出的最优条件是可靠的。

2.3抑菌效果

从山蓝提取液中柱层析分离出的红色素,在测试条件下对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌表现出抑菌效果见表3。说明山蓝提取液柱层析分离得到的红色素含有抑制该四种供试菌种的物质,与其他植物红色素[14-15]的抑菌活性相比,有的差异比较大,有的相差不多。由于初步纯化后得到的依然是混合物,也可能是该混合物中还有一些能够抑制实验所用四种菌种的物质。

表3　抑菌效果

3　结论

采用微波萃取仪对山蓝植物进行了水溶液提取,通过柱层析分离收集红颜色部分进行抑菌实验。微波提取时间、料液比、提取温度和微波功率对提取效果有影响,影响程度依次为提取时间>提取温度>料液比>微波功率,微波功率300 W,料液比1∶40(m/V),提取温度60 ℃,提取时间9 min为最佳提取条件,山蓝红色素提取率达到0.323%,并具有比较好的稳定性。抑菌实验表明,山蓝红色素对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、金黄色葡萄球菌均表现出抑菌效果。

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Microwave-assisted extraction and antibacterial activity of red pigment from Shanlan

ZHANG Zhen-fa1,WENG Yan-ying1,PENG Jin-yun1,HUANG Sun-juan1,NONG Ke-liang1,2,*

(1.Department of Chemical and Biological Engineering,Guangxi Normal University for Nationalities,Guangxi Colleges and Universities Key Laboratory Breeding Base of Chemistry of Guangxi Southwest Plant Resources,Chongzuo 532200,China;2.Guangxi College of Education,Nanning 530023,China)

Red pigment was extracted from Shanlan when water as solvent with microwave-assisted extraction. Optimization of extraction conditions was carried out through single factor and orthogonal experiments. The red pigment was separated and purified by column chromatography for bacteriostatic experiment. The optimum conditions were obtained as microwave power 300 W,ratio of solid to liquid 1∶40,temperature 60 ℃ and the extracting time 9 min,and the extraction rate was 0.323%. The red pigment had inhibitory effect onEscherichiacoli,Bacillussubtilis,CandidaalbicansandStaphylococcusaureus,and the minimum inhibitory concentration was respectively 500,400,700,500 mg·L-1.

red pigment;microwave extraction;antibacterial activity

2016-02-19

张贞发(1982-)，男，硕士，讲师，研究方向：天然产物提取及分析，E-mail：865289575@qq.com。

农克良(1964-)，男，硕士，教授，研究方向：药物化学，E-mail：2453802800@qq.com。

广西优势特色重点学科项目(ZDXK-A2012002)；广西民族师范学院科研项目(XYYB2011018)。

TS201.2

B

1002-0306(2016)16-0312-04

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.053