基于配子的抗生素检测研究进展

蔡义林,袁爱梦,蔡珺珂,李　彤,李　颖,齐　斌,朱颖越,*

(1.常熟理工学院,生物与食品工程学院,江苏常熟 215500;2.中国矿业大学化工学院,江苏徐州 221000)



基于配子的抗生素检测研究进展

蔡义林1,2,袁爱梦1,蔡珺珂1,李彤1,李颖1,齐斌1,朱颖越1,*

(1.常熟理工学院,生物与食品工程学院,江苏常熟 215500;2.中国矿业大学化工学院,江苏徐州 221000)

抗生素因其疗效显著被广泛的使用,然而其滥用对人类所带来的危害也逐渐被重视。核酸配子作为一种“化学抗体”,随着配子筛选技术的改进对靶目标具有更高的特异性和亲和力。本文对以核酸配子为基础所建立的生物传感方法检测抗生素的研究进展做了概括,分别从电化学、光学、酶联免疫等方面对近些年来学者构建的新型传感方法进行介绍,以展现配子技术在抗生素检测上的研究方法和应用潜力。

核酸配子,抗生素,传感器,检测

抗生素是生物在其生命活动中产生的能选择性抑制和影响他种生物功能的有机物质,其在促进生长、治疗和预防感染性疾病方面得到广泛且大量的应用,不可避免的造成环境中抗生素的残留,最终可经过食物链在人体内累积,导致人身体内微生物环境平衡的紊乱和失调,对人体健康造成威胁[1-3]。

配子是指能与靶分子特异性结合的核苷酸序列[4-5]。相对于传统的蛋白抗体,配子能与靶目标结合形成更稳定的化合物且特异性较高。一种物质的配子筛选时间并不长,可以通过PCR技术放大,进而能大量制备。配子制备简单,易于修饰,并能长期保存,且与目标物作用条件可控。因此配子基传感技术具有很好的应用前景。本文在总结国内外相关研究的基础上,结合配体技术在抗生素检测方向的研究方法与类型,以及环境中几种典型抗生素(四环素、土霉素和磺胺类等)的残留检测方法,对现阶段配子基生物传感技术进行了分类和对比分析。

1　抗生素配子的筛选和构建

经典的配子指数富集的配基系统进化技术[6]将靶目标与文库进行混合反应,结合分离技术和PCR扩增分离出靶目标的配子文库,并对文库进行克隆、测序,筛选出单一配子。随着磁珠、毛细管电泳以及PCR等技术的发展,筛选技术得到不断的提高。研究者们通过SELEX技术在寡核苷酸库中筛选出对目标物具有高特异性、高亲和力的抗生素配子。

Song等[7]通过亲和色谱法在试管内筛选出对卡那霉素具有特异性绑定的卡那霉素配子DNA(ssDNA),荧光强度分析表明其与卡那霉素的解离常数为78.8nmol/L。Mehta等[8]通过筛选技术设计了氯霉素的DNA配子,得到两段富含鸟嘌呤G(>35%)的氯霉素配子,通过对配子绑定分析,其分离常数为0.8和1 μmol/L。Zhou等[9]利用修饰的磁珠结合指数富集配体系统进化技术(SELEX技术)得到链霉素的配子DNA,非线性回归分析表明,此配子的分离常数为199.1 nmol/L,且具有很好的特异性。Kim等[10]通过间接性酶联免疫竞争实验和SELEX技术筛选得到土霉素的配子DNA,分离常数为4.7 nmol/L,远远低于先前Niazi[11]筛选出的土霉素配子分离常数56.84 nmol/L。

表1　荧光传感检测抗生素

2　配子识别技术在抗生素检测中的应用

2.1抗生素常用的检测方法分析

食品中抗生素残留检测受到人们的广泛关注。高效液相色谱法(HPLC)、酶联免疫吸附实验(ELISA)、表面等离子体共振以及毛细管电泳法等[12-14]已经被应用于检测抗生素。然而,这些方法操作繁琐,耗时长,通常需要复杂的样品预处理和昂贵的仪器。配子传感器具有较好的选择性,灵敏度,构造简单，操作方便。此外,核酸配子作为生物探针,可以通过碱基配对作用以及分子内作用,形成不同的三维空间结构或闭合结构,具有较高的灵活性,通过特殊设计的配子已经被学者应用于抗生素的检测[15-16]。

2.2配子基荧光传感检测抗生素

荧光传感技术是基于具有荧光效应的化学物质或量子点构建的配子基生物传感器,通过核酸配子与目标物的变构作用,提供增强或减弱激发单重态的环境或以能量共振转移为基础,改变荧光量子效率,实现对目标物质的检测(表一)。

Li等[17]通过酰胺反应EDC-NHS方法将氨基化的卡那霉素配体标记到十八烯酸修饰的稀土上转换发光材料(NaYF4:Yb,Er)上,由于ssDNA与石墨烯之间的π-π相互堆积作用,使能量供体稀土上转换发光材料和能量受体石墨烯靠近,两者发生能量共振转移,引起荧光淬灭,但当加入卡那霉素后,配子与卡那霉素作用形成发夹结构,从而不能吸附在石墨烯上,基于此构建的荧光传感器的检测限可达9 pmol/L,线性范围为0.01～3 nmol/L。Leung等[18]利用四面体荧光物质铂复合物[Pt(CN＾N)Cl]单独存在时较弱的荧光效应,而与双链DNA共存时荧光得到加强的特性,设计了一种配子基荧光传感器,当卡那霉素不存在时,DNA呈自由状态,体系荧光强度无变化,卡那霉素的加入使ssDNA转变为一个包含发夹结构形态,此时铂复合物存在于ssDNA构象中荧光得到增强。

Chen等[19]利用银纳米簇(AgNCs)与DNA胞嘧啶的组合发光效应,将磁珠与DNA进行结合,磁珠上DNA的互补DNA为赭曲霉毒素A配子,当体系中含有赭曲霉毒素A时,与其配子特异性结合,磁珠分离过程中,上清液体系中仍存在含有胞嘧啶的配子,当加入Ag+/NaBH4时,生成的银纳米簇与胞嘧啶作用发出荧光,荧光强度与赭曲霉毒素A浓度呈正相关性,此荧光传感器的检测限达到2 pg/mL。Wu等[20]将生物素修饰的氯霉素配子与亲和素修饰的磁纳米颗粒(Fe3O4MNPs)相结合,将氨基化的与配子互补的DNA与纳米上转换荧光纳米材料(NaYF4:Yb,Er)相结合,当溶液中有含有氯霉素时,磁纳米颗粒上的配子与氯霉素连接,不能与互补DNA修饰的荧光纳米材料形成二聚体,在磁力分离作用下,分离体系中的荧光信号强度发生改变,以此可以检测氯霉素,检测限可达0.01 ng/mL,线性范围为(0.01～1) ng/mL,研究者将这种检测方法应用于牛奶样品中的氯霉素检测,得到较好结果。

2.3配子基比色传感检测抗生素

比色生物传感技术广泛应用于配子基生物传感器,此类传感技术大部分以金纳米体系为基础,结合目标物与配子之间的高亲和力特性,以及ssDNA的碱基互补配对和具有的负电性磷酸骨架,改变溶液中盐或阳离子聚合物等能引起金纳米体系聚集物质的浓度,在体系的吸光值与目标物质的浓度建立对应关系,实现对目标物的识别检测(表2)。

Song等[7]将卡那霉素配子应用于金纳米比色传感器的构建,由于DNA能附着在纳米金表面,对一定盐浓度的金纳米溶液具有分散作用,当在溶液中加入卡那霉素后,配子与卡那霉素结合从纳米金表面剥落,不能维持特定盐浓度下金纳米的分散性,溶液的吸光度发生改变,基于此特性构建的生物传感器检测限为25 nmol/L。Zhou等[9]同样利用纳米金比色方法检测链霉素,通过紫外扫描得到的检测范围为0.2～1.2 μmol/L,通过蜂蜜中的加标回收实验表明所构建比色传感器具有很好的实际应用前景。Kim等[21]采用类似比色方法以土霉素配子检测土霉素,得到的检测限为25 nmol/L,完全满足美国环保局对此类抗生素的检测要求。Niu等[22]利用卡那霉素配子、腺苷酸配子以及磺胺地索幸配子构建的金纳米比色传感器,根据不同的纳米金溶液的颜色变化(红色-紫色/蓝色)实现了三种物质的同时检测分析。

表2　比色传感检测抗生素

2.4配子基电化学传感检测抗生素

电化学配子传感器是由固定了适体的电极和电化学活性识别元素构成。将配子作为分子识别元素固定在电极上,以电化学电极作为换能器,当待测目的物加入电极体系,目的物与适体作用从而导致电极表面结构的变化,然后通过检测电极表面电活性识别元素的电信号来达到识别和鉴定靶物质的目的(表3)[23-24]。

Zheng等[27]建立一种老鼠血样中土霉素的测定方法,土霉素配子互补DNA两端分别修饰上氯化二茂铁和巯基,将此DNA连接在电极表面,利用DNA的碱基互补性使氯化二茂铁远离电极表面,加入土霉素后,配子被竞争性剥离,氯化二茂铁靠近电极表面进而改变电子传递效应,所构建传感器对鼠血样中土霉素的具有很好的检测结果。Sanaz[28]同样以氯霉素配子构建的金电极传感器检测氯霉素,得到的检测限为1.9 nmol/L。Sun等[29]将壳聚糖-金纳米颗粒(CS-AuNPs),石墨烯-金纳米颗粒(GR-AuNPs),多壁碳纳米管-酞菁钴材料(MWCNTs-CoPc)组合应用于卡那霉素的检测,首先将CS-AuNPs、GR-AuNPs、MWCNTs-CoPc纳米混合物依次滴定在金电极上,通过各纳米复合物的协同效应加强电子传递效率和电极的灵敏度,然后将氨基化的卡那霉素配子1修饰在混合物表面,用牛血清蛋白阻塞未连接配子的活性位点,加入链霉亲和素-辣根过氧化物酶-配子2混合物构成整个检测系统,当加入卡那霉素后,辣根过氧化物酶的电子传递效应循环增加,检测过氧化物酶催化双氧水氧化反应多产生的电流效应以确定卡那霉素的浓度。所构建方法具有很高的灵敏度和特异性且检测限达5.8 nmol/L。

表4　免疫学传感检测抗生素

水凝胶是由亲水性聚合物构成的具有三维网状结构的类似于软组织的物理胶体,能与大量水融合,具有生物相容性,其电化学性能已经被广泛研究[29-30]。Ezat等[31]通过碱性处理从动物蛋白中得到一种胶质,将巯基化氯霉素配子修饰在金电极上,然后用胶质包裹制成一种电化学芯片,当滴加氯霉素在电极表面时,由于配子目标物的特异性结合导致金电极表面电流发生变化,以此来检测氯霉素的含量,检测限为0.183 nmol/L,具有较好的选择性和稳定性。

2.5配子基酶联免疫吸附传感检测抗生素

酶联免疫吸附是将抗原抗体免疫反应的特异性和酶的高效催化结合起来用于检测的一种技术。核酸配子作为“化学抗体”对目标物质具有很高的亲和力和特异性,且制备简单,便于修饰,故作为单链小分子的适体分子具有优越性,而以适体为基础的新型生物传感器更胜一筹。以酶联核酸适体分析为基础的检测方法,因其检测的简单性可广泛应用于食品抗生素检测。

Lise等[32]在通过直接或间接酶联竞争反应实现了目标物的检测,在直接酶联竞争检测中,将牛血清蛋白修饰的赭曲霉素连接在管壁上,牛血清固定的赭曲霉素和自由赭曲霉素竞争性绑定生物素修饰的配子,然后利用链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶对四甲基联苯胺的催化颜色反应确定赭曲霉素的浓度,所建立方法的检测限为10 ng/mL。间接性竞争检测就是用亲和素将生物素标记的赭曲霉素配子固定在管壁上,利用辣根过氧化物酶标记的赭曲霉素和自由赭曲霉素之间竞争性绑定配子,然后通过辣根过氧化物酶的催化变色作用确定赭曲霉素的浓度,检测限为1.4 ng/mL。Kim等[10]设计了一种类似的间接性酶联竞争实验检测土霉素,通过加入生物素标记的土霉素配子和非标记的土霉素进行竞争性绑定,对土霉素的检测限为12.3 μg/L,并成功应用于牛奶样品中土霉素的检测。Wang等[33]利用间接性酶联竞争反应实现了对四环素的检测,线性检测范围为0.1～1000 ng/mL,检测限为0.0978 ng/mL,将其应用于蜂蜜中四环素的检测,回收率在92.09%～109.7%之间。

2.6其它配子基生物传感检测抗生素

表面等离子体共振波谱是一种免标记高灵敏技术,能够详细提供表面亲和力和生物分子相互作用的亲和力和动力学信息。相较于其它方法,由表面等离子体共振得到的动力学和绑定常数信息更加方便,快速,便于操作。加入分析物质后,通过检测金阵列的表面共振角改变确定绑定过程的信息,结合配子科技,这种技术已经被应用于抗生素的检测[34]。N de los等[16]采用表面等离子体技术建立的方法实现了对新霉素B的检测,检测范围达10～100 μmol/L,并且具有很好的特异性。

悬臂阵列传感器作为一种能实时、高灵敏度的检测技术近些年来受到很多学者的关注,悬臂阵列传感技术具有较小的尺寸,灵敏的动力学响应和较高的准确度,能够将分子识别作用直接转换为纳米力学响应信号。通过将功能化的受体分子固定在传感器上,目标分子被捕捉时会在传感器的表面产生不同的压力信号,基于此实现对目标分子的检测[35-36]。Hou等[37]采用悬臂阵列传感技术,将巯基化的土霉素配子绑定在单层分子膜悬臂上,将6-巯基1-乙醇化的单层分子膜作为参比悬臂,当土霉素被配子绑定后,悬臂表面的压力信号发生变化,以此检测土霉素得到的线性范围是1.0～100 nmol/L,检测限为0.2 nmol/L。

抗体-抗原的特异结合性质容易引起抗体修饰的微球体聚集,这种改变能够通过统计学或光散射的方法进行监测[38-39]。采用此原则,将表面固定有抗体的胶体微球与抗原进行反应,可以通过光散射强度检测抗原的浓度。Kim等[40]将氨基化的土霉素配子视为化学抗体,固定在羧基化的微球表面,当加入土霉素时,由于土霉素配子具有多绑定区域,会引起微球的聚集,改变光散射强度,所构建方法的检测限可达100 μg/L,线性范围为100～104 μg/L，并且具有很好的特异性。

3　结论与展望

抗生素对人类健康的威胁已成为重大环境问题,发展简单高效,快速灵敏的抗生素检测方法至关重要。SELEX技术结合新型筛选体系的构建,使得目标配子的筛选更加容易,而且配子作为“化学抗体”合成简单,具有类似于抗体-抗原的特异性结合性质。随着新型材料的应用和纳米技术的发展,氧化石墨烯、磁纳米颗粒、金纳米颗粒、荧光量子点等,使各类生物传感器的构建变的容易,实时检测能力也得到提高。

综上所述,相较于传统的检测系统,配子基生物传感器极具发展潜力。由于此类生物传感器的灵敏度受到体系温度、pH以及降解酶等的干扰,作为一种应用型的分析检测技术还需要进行改进。筛选技术的发展和后处理方法的完善,可以使筛选配子的专一性、亲和力以及抗降解能力得到提高,配子基传感技术的多样化、简便性以及可靠性必将为抗生素的实际检测提供可行的应用研究基础,为抗生素的快速检测提供新型的方法。

[1]朱婷婷,宋战锋,段标标,等. 深圳石岩水库抗生素污染特征与健康风险初步评价[J]. 环境与健康杂志,2013,30(11):1003-1006.

[2]王冲,罗义,毛大庆. 土壤环境中抗生素的来源,转归,生态风险以及消减对策[J]. 环境化学,2014,33(1):19-29.

[3]刘宾,刘颖,义志忠,等. 适体在抗生素残留检测中的应用[J]. 食品科学,2010(17):452-456.

[4]杨锡辉,孔维军,杨美华,等. 配子识别技术在真菌毒素快速分析中的应用[J]. 分析化学,2013,41(2):297-306.

[5]刘佳琦. 生物传感器在重金属离子检测中的应用[J]. 广州化工,2013,41(12):165-167.

[6]张慧卿,方念,张焜和. 配子筛选技术[J]. 中国生物工程杂志,2008,28(1):113-118.

[7]Song K M,Cho M,Jo H,et al. Gold nanoparticle-based colorimetric detection of kanamycin using a DNA aptamer[J]. Analytical Biochemistry,2011,415(2):175-181.

[8]Mehta J,Van Dorst B,Rouah-Martin E,et al.Invitroselection and characterization of DNA aptamers recognizing chloramphenicol[J]. Journal of Biotechnology,2011,155(4):361-369.

[9]Zhou N,Wang J,Zhang J,et al. Selection and identification of streptomycin-specific single-stranded DNA aptamers and the application in the detection of streptomycin in honey[J]. Talanta,2013,108:109-116.

[10]Kim C H,Lee L P,Min J R,et al. An indirect competitive assay-based aptasensor for detection of oxytetracycline in milk[J]. Biosensors and Bioelectronics,2014,51:426-430.

[11]Niazi J H,Lee S J,Kim Y S,et al. ssDNA aptamers that selectively bind oxytetracycline[J]. Bioorganic & Medicinal Chemistry,2008,16(3):1254-1261.

[12]Morovján G,Csokan P P,Németh-Konda L. HPLC determination of colistin and aminoglycoside antibiotics in feeds by post-column derivatization and fluorescence detection[J]. Chromatographia,1998,48(1-2):32-36.

[13]Jin Y,Jang J W,Han C H,et al. Development of ELISA and immunochromatographic assay for the detection of gentamicin[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry,2005,53(20):7639-7643.

[14]Popelka P,Nagy J,Popelka P,et al. Comparison of various methods for penicillin residue detection in cow milk after intramammary and parenteral treatment[J]. Bulletin-Veterinary Institute In Pulawy,2003,47(1):203-210.

[15]Kim Y J,Kim Y S,Niazi J H,et al. Electrochemical aptasensor for tetracycline detection[J]. Bioprocess and Biosystems Engineering,2010,33:31-37.

[16]N De los Santos-Alvarez,Lobo-Castaón A J,Miranda-Ordieres A J,et al. SPR sensing of small molecules with modified RNA aptamers:detection of neomycin B[J]. Biosensors and Bioelectronics,2009,4:2547-2553.

[17]Li H,Sun D,Liu Y,et al. An ultrasensitive homogeneous aptasensor for kanamycin based on upconversion fluorescence resonance energy transfer[J]. Biosensors and Bioelectronics,2014,55:149-156.

[18]Leung K H,He H Z,Chan D S H,et al. An oligonucleotide-based switch-on luminescent probe for the detection of kanamycin in aqueous solution[J]. Sensors and Actuators B:Chemical,2013,177:487-492.

[19]Chen J,Zhang X,Cai S,et al. A fluorescent aptasensor based on DNA-scaffolded silver-nanocluster for ochratoxin A detection[J]. Biosensors and Bioelectronics,2014,57:226-231.

[20]Wu S,Zhang H,Shi Z,et al. Aptamer-based fluorescence biosensor for chloramphenicol determination using upconversion nanoparticles[J]. Food Control,2015,50:597-604.

[21]Kim Y S,Kim J H,Kim I A,et al. A novel colorimetric aptasensor using gold nanoparticle for a highly sensitive and specific detection of oxytetracycline[J]. Biosensors and Bioelectronics,2010,26(4):1644-1649.

[22]Shucao N,Zhenzhen L,Jinchuan L,et al. Colorimetric aptasensor using unmodified gold nanoparticles for homogeneous multiplex detection[J]. Plos One,2014,9(10):56.

[23]Su S,Nutiu R,Filipe C D M,et al. Adsorption and covalent coupling of ATP-binding DNA aptamers onto cellulose[J]. Langmuir,2007,23:1300-1302.

[24]Xu D K,Xu D W,Yu X B,et al,Label-free electrochemical detection for aptamer-based array electrodes[J]. Anal Chem,2005,77:5107-5113.

[25]Kim Y S,Niazi J H,Gu M B. Specific detection of oxytetracycline using DNA aptamer-immobilized interdigitated array electrode chip[J]. Analytica Chimica Acta,2009,634:250-254.

[26]Eva G F,Noemí D L S á,María Jesús L C,et al. Impedimetric aptasensor for tobramycin detection in human serum[J]. Biosensors and Bioelectronics,2011,26(5):2354-2360.

[27]Zheng D Y,Zhu X L,Zhu X J,et al. An electrochemical biosensor for the direct detection of oxytetracycline in mouse blood serum and urine[J]. Analyst,2013,138(6):1886-1890.

[28]Sanaz P,Jaytry M,Freddy D,et al. Aptasensing of Chloramphenicol in the Presence of Its Analogues:Reaching the Maximum Residue Limit[J]. Analytical Chemistry,2012,84(15):6753-6758.

[29]Lian S,Xiao Y,Bian Q,et al. Injectable hydrogel as stem cell scaffolds from the thermosensitive terpolymer of NIPAAm/AAc/HEMAPCL[J]. International Journal of Nanomedicine,2012,7:4893-4905.

[30]Wang H,Hansen M B,Löwik,D W P M,et al. Leeuwenburgh,S.C.G. Oppositely charged gelatin nanospheres as building blocks for injectable and biodegradable gels[J]. Advanced Materials,2011,23:H119-H124.

[31]Ezat H A,Freddy D,Ronny B,et al. An improved electrochemical aptasensor for chloramphenicol detection based on aptamer incorporated gelatine[J]. Sensors,2015,15(4):7605-7618.

[32]Barthelmebs L,Jonca J,Hayat A,et al. Enzyme-Linked Aptamer Assays(ELAAs),based on a competition format for a rapid and sensitive detection of Ochratoxin A in wine[J]. Food Control,2011,22(5):737-743.

[33]Wang S,Liu J,Wei Y,et al. A direct competitive assay-based aptasensor for sensitive determination of tetracycline residue in Honey[J]. Talanta,2015,131c:562-569.

[34]Veronika O,Hana V,Jirí H,et al. Effect of the immobilisation of DNA aptamers on the detection of thrombin by means of surface plasmon resonance[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry,2008,391(5):1861-1869.

[35]Goeders K M,Colton J S,Bottomley L A. Microcantilevers:Sensing Chemical Interactions via Mechanical Motion[J]. Chemical Reviews,2008,108:522-542.

[36]Cherian S,Gupta R K,Mullin B C. Detection of Copper Ions using Microcantilever Immunosensors and Enzyme-linked Immunosorbent assay[J]. Biosensors and Bioelectronic,2003,19:411-416.

[37]Hou H,Bai X,Xing C,et al. Aptamer-based cantilever array sensors for oxytetracycline detection[J]. Analytical Chemistry,2013,85(4):2010-2014.

[38]Lee J F,Stovall G M,Ellington A D. Aptamer therapeutics advance[J]. Current Opinion in Chemical Biology,2006,10:282-289.

[39]Kim Y S,Jung H S,Matsuura T,et al. Electrochemical detection of 17β-estradiol using DNA aptamer immobilized gold electrode chip[J]. Biosensors and Bioelectronic,2007,22:2525-2531.

[40]Kim K,Gu M,Kang D,et al. High-sensitivity detection of oxytetracycline using light scattering agglutination assay with aptasensor[J]. Electrophoresis,2010,31(18):3115-3120.

Research advance in antibiotics detection based on aptamer

CAI Yi-lin1,2,YUAN Ai-meng1,CAI Jun-ke1,LI Tong1,LI Ying1,QI Bin1,ZHU Ying-yue1,*

(1.School of Biotechnology and Food Engineering,Changshu Institute of Technology,Changshu 215500,China;2.School of Chemical Engineering & Technology,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221000,China)

Antibiotics has been widely used for its distinctive curative effect in the treatment of diseases,however,the overuse of antibiotics and harmful social problems has become a public problem affecting public health. Aptamers,a kind of chemical antibodies,reveal higher specificity and affinity to target with the improvement of aptamer screening technology. In this paper,the latest research recently for some sensing methods based on aptasensing technologies were summarized,from the electrochemistry,optics and enzyme-linked immunology respectively,which showed the application ability of aptamers in antibiotics detection and its potential applications in the exploration of research methods.

aptamer;antibiotics;sensor;detection

2016-01-20

蔡义林(1989-)，男，硕士，研究方向：生物检测分析，E-mail：yilin10sky@163.com。

朱颖越(1983-)，男，博士，讲师，研究方向：食品安全与检测，E-mail：yyzhujnu@163.com。

江苏省基础研究计划(自然科学基金)项目(BK20130379，BK20140416)；江苏省“六大人才高峰”第十二批高层次人才选拔培养(NY-021)；苏州市科技计划项目(SYN201515)；2016年度大学生创新创业训练计划项目(省级立项)资助。

TS207.3

A

1002-0306(2016)16-0368-06

10.13386/j.issn1002-0306.2016.16.065