Fe3O4@NiSiO3对水中痕量微囊藻毒素的萃取

郭亭秀，娄大伟，连丽丽，王希越，陈慧君,3，李秋颖，王润楠

(1.吉林化工学院　化学与制药工程学院，吉林　吉林　132022；2.东北师范大学　化学学院，吉林长春　130024；3.吉林大学　化学学院，吉林　长春　130012)



Fe3O4@NiSiO3对水中痕量微囊藻毒素的萃取

郭亭秀1,2，娄大伟1*，连丽丽1，王希越1，陈慧君1,3，李秋颖1，王润楠1

(1.吉林化工学院化学与制药工程学院，吉林吉林132022；2.东北师范大学化学学院，吉林长春130024；3.吉林大学化学学院，吉林长春130012)

通过水热合成法和溶胶凝胶法制备Fe3O4@NiSiO3磁性纳米粒子，该纳米粒子微球具有均一的形貌、良好的磁性和分散性。将合成的Fe3O4@NiSiO3磁性纳米粒子作为磁性固相萃取(MSPE)介质，并结合高效液相色谱(HPLC)建立了水样中痕量微囊藻毒素MC-LR的分析方法。在优化实验条件下，方法在0.25～146.5 μg/L浓度范围内呈良好的线性关系，相关系数(r)为0.999 1，检出限为0.011 μg/L。将该方法用于纯水中微囊藻毒素的分析，回收率为81.0%，对实际水样的回收率为66.7%～72.0%。表明Fe3O4@NiSiO3磁性纳米粒子具有良好的选择性富集能力，可用于水中痕量微囊藻毒素的萃取。

磁性固相萃取；高效液相色谱；微囊藻毒素；磁性纳米粒子

世界范围内的水体富营养化导致水中有毒微生物大量繁殖，淡水资源中主要的有毒微生物是蓝藻，蓝藻大量繁殖时会释放有毒物质微囊藻毒素(Microcystins，MCs)。MCs具有环状七肽结构，至今已发现80余种变体，其中Microcystins-LR(MC-LR)最有代表性。MCs能够诱发肝癌，由其引起的中毒事件时有发生，因此蓝藻爆发引起的淡水水源污染问题引起了人们的高度关注[1-5]。

固相萃取(SPE)是近年来发展迅速的一种样品前处理技术，具有操作简单、消耗有机溶剂少和富集效率高等特点。磁性固相萃取(MSPE)是在其基础上发展起来的新型样品前处理技术，MSPE的应用使得洗脱溶剂用量大为减少，避免了SPE技术吸附柱易堵的问题，而且MSPE使用的磁性材料可重复利用[6-7]，该技术已广泛应用于环境和食品等领域中痕量物质的萃取分析[8-10]。磁性粒子的合成方法有水热法、胶束法和热分解法等，水热法因制备的磁性粒子纯度高、分散性好和大小可控而被广泛使用[11]。常见的磁性纳米粒子以磁铁矿(Fe3O4)和赤铁矿(γ-Fe2O3)为主，为防止其被氧化并使之拥有特异性，常对其表面进行修饰，包裹二氧化硅是最常见的手段[12-14]。微囊藻毒素的检测有多种方法[15-17]，其中高效液相色谱法因准确度和重复性好而被广泛使用。近年来，样品前处理(包括固相萃取、微波萃取、超临界萃取等)与高效液相色谱检测技术结合常被用于痕量物质的分离分析，前者可排除对色谱检测的不利因素，后者为前者提供了分析条件[18-19]。

本文首先采用水热法制备出球形的Fe3O4，并将其表面包覆硅外壳，再由Fe3O4@SiO2制备出Ni2+修饰的磁性纳米粒子。该制备方法简单，且合成的Fe3O4@NiSiO3纳米微球具有磁性强、比表面积大、可重复利用等特点，其表面具有强配位能力的金属Ni2+，使得Fe3O4@NiSiO3可以通过配位作用将水中痕量的生物毒素MC-LR选择性地富集于其表面。基于此，本文利用Fe3O4@NiSiO3对MC-LR的萃取性能，对吸附剂用量、萃取时间、洗脱液配比等因素进行优化后，建立了大体积水样中痕量生物毒素MC-LR的MSPE技术，并与HPLC联用实现了目标物的准确定量分析。

1　实验部分

1.1仪器与试剂

1260高效液相色谱(美国Agilent 公司)，H-800型透射电子显微镜(日本Hitachi公司)，JSM-6700F型冷场扫描电子显微镜(日本JEOL公司)，MPMSXL-5震动样品磁强计(美国Quantum Design公司)，Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)，N-EVAPTM111氮吹仪(美国Organomation公司)，As3120超声波清洗器(加拿大Autoscience公司)，DZF-6051真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，FP115鼓风干燥箱(德国宾得公司)，XW-80A型旋涡混合仪(海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

微囊藻毒素(MC-LR，台湾Algal Science公司)，配成5 000 μg/L的标准品储备液，于 4 ℃冰箱中避光保存。甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮(色谱纯，瑞典欧普森公司)；三氟乙酸(色谱纯)、NiCl2·6H2O(分析纯)购自于阿拉丁化学试剂公司；实验用超纯水和二级水均由Milli-Q超纯水系统制备；无水醋酸钠(天津大茂化学试剂制造有限公司)；正硅酸乙酯(TEOS)、氯化铵、氨水(天津市北方天医化学试剂)；乙二醇、三氯化铁(天津市永大化学试剂开发中心)；聚乙二醇(成都市联合化工试剂研究所)；除特别注明外，所用试剂均为分析纯，实验用水为蒸馏水。

1.2核壳结构磁性纳米粒子的制备

1.2.1Fe3O4磁性纳米粒子的制备Fe3O4磁性纳米粒子的制备采用水热合成法[20]，称取1.35 g的 FeCl3·6H2O分散在40 mL乙二醇中，搅拌均匀后加入3.60 g NaAc和1.00 g聚乙二醇，持续搅拌直至形成均一黏稠液体。将混合液转移到50 mL水热合成釜中，在180 ℃下反应8 h，冷却至室温后，利用磁铁分离出黑色固体Fe3O4纳米粒子，经多次水洗和醇洗后，于真空条件下60 ℃ 干燥2 h，回收备用。

1.2.2Fe3O4@SiO2磁性纳米粒子的制备称取0.1 g的Fe3O4磁性纳米粒子，用50 mL 0.1 mol/L的HCl溶液超声处理20 min，经磁铁磁性分离处理后的Fe3O4纳米粒子，用水多次洗涤至中性，并将其分散到含有75 mL无水乙醇和25 mL二级水的四颈烧瓶中，同时加入2 mL氨水(28%)，搅拌均匀后逐滴缓慢加入TEOS，加入比例为n(TEOS)∶n(Fe3O4)=5∶1，机械搅拌3 h后，磁铁磁性分离Fe3O4@SiO2，经多次水洗和醇洗后，真空条件下60 ℃ 干燥2 h，回收备用。

1.2.3Fe3O4@NiSiO3粒子的制备将0.1 g Fe3O4@SiO2分散在20 mL二级水中，依次加入0.238 g NiCl2·6H2O和0.535 g NH4Cl于另外20 mL二级水中，同时加入1 mL氨水(28%)，将两份水溶液超声均匀后再混合，转移至聚四氟乙烯反应釜中，140 ℃下反应12 h，冷却后用磁铁分离Fe3O4@NiSiO3，经多次水洗和醇洗，真空干燥2 h，装瓶备用。

1.3高效液相色谱检测条件

色谱柱：Agilent SB-C18(150 mm ×4.6 mm，5 μm)；柱温：30 ℃；检测波长：238 nm；流动相：甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(65∶35)，流速：1 mL/min；进样量：20 μL。依据保留时间进行定性。

1.4磁性固相萃取

称取一定质量的Fe3O4@NiSiO3分散至10 mL MC-LR样品溶液中，涡流振荡一定时间后，将磁铁置于样品瓶一侧分离出负载MC-LR的Fe3O4@NiSiO3，加入一定配比的洗脱液对磁性粒子表面的MC-LR进行超声洗脱，氮气浓缩后加入200 μL超纯水定容，进行高效液相色谱分析。

2　结果与讨论

2.1磁性纳米粒子的表征

采用扫描电子显微镜(SEM)、透射电子显微镜(TEM)和震动磁强计对磁性纳米粒子的形貌及磁饱和度进行表征。图1A、B为Fe3O4@NiSiO3的SEM图，可观察到Fe3O4@NiSiO3呈球状，其粒径均一、表面粗糙。图1C为Fe3O4@NiSiO3的TEM图，其粒径约为250 nm，呈核壳结构，核为黑色的实心球体Fe3O4，表面包覆布满毛刺的空心NiSiO3外壳。毛刺状硅酸镍外壳的成功修饰不但增大了磁性粒子的比表面积，而且通过Ni2+与MC-LR分子中羧基与氨基的配位作用，增强了其对MC-LR的选择性萃取能力。由磁性纳米粒子的磁滞回线图可观察到，磁性纳米粒子的磁力曲线平滑，表明该粒子具有较好的顺磁性，其饱和磁性(Ms)值为 20.14 emu/g(图1D)。

图1　磁性纳米粒子Fe3O4@NiSiO3的扫描电镜(A，B)、透射电镜(C)和磁滞回线(D)图Fig.1　Photographs of scanning electron microscope(A，B)，transmission electron microscope(C) and hysteresis loop(D) of Fe3O4@NiSiO3 magnetic nanoparticles

图2　MC-LR标准溶液的高效液相色谱图Fig.2　HPLC chromatogram of MC-LR standard solution

2.2磁性固相萃取条件的优化

2.2.1HPLC检测结果1 000 μg/L MC-LR标准品在HPLC条件下的色谱图如图2所示。各磁性固相萃取条件优化过程中得到的样品均在此条件下进行检测。

2.2.2吸附条件分别将2～18 mg Fe3O4@NiSiO3加至10 mL 20 μg/L的MC-LR加标溶液中，考察了吸附剂用量的影响。结果显示，在2～12 mg范围内，随着吸附剂的加入量增大，MC-LR的回收率增加，12 mg时达到最大回收率，继续增大加入量时回收率开始下降。因此选择12 mg作为Fe3O4@NiSiO3吸附剂的加入量。

称取12 mg Fe3O4@NiSiO3加至10 mL 20 μg/L的MC-LR样品溶液中，考察了萃取时间分别为10，20，30，40，50，60 min时的回收率。结果显示，在10～30 min范围内，随着萃取时间的延长，MC-LR的回收率逐渐增加，当萃取时间继续延长(30～60 min)时，回收率变化不大，说明30 min已达到萃取平衡。因此选择30 min为最佳萃取时间。

图3　不同比例乙腈对MC-LR洗脱的影响Fig.3　Effect of different proportions of acetonitrile for MC-LR elutedFe3O4@ NiSiO3 NPs：12 mg;sample：10 mL 20 μg/L MC-LR;extraction time：30 min;desorption elution volume：200 μL，acetonitrile-0.2% CF3COOH;desorption time：30 min；desorption times：three times

2.2.3解吸条件洗脱液的选择对回收率具有重要影响。分别选择甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮作为洗脱液进行对比实验，结果表明乙腈具有最高的萃取效率。然后选择200 μL不同比例的乙腈-0.2%三氟乙酸水溶液作为洗脱剂，在超声条件下对吸附剂表面的MC-LR进行洗脱，结果如图3所示。当乙腈-0.2%三氟乙酸水溶液体积比为3∶1时，MC-LR的回收率最高。对洗脱时间的考察结果表明，最佳解吸附时间为15 min，此时达到解吸平衡。

洗脱液的pH值直接影响吸附剂及MC-LR分子的表面电荷，通过在洗脱液中加入三氟乙酸，考察了pH值对萃取结果的影响(调整水中三氟乙酸的体积分数分别为0%，0.1%，0.2%，0.3%)。结果显示，三氟乙酸的加入可显著增强洗脱效果，当其体积分数为0.2%时，MC-LR的回收率最大。因此实验选择水中三氟乙酸的最佳体积分数为0.2%。

为提高回收率，研究了洗脱次数对萃取结果的影响。实验结果表明洗脱2次时已洗脱完全，在该条件下，磁性粒子对10 mL 20 μg/L 的MC-LR样品液中MC-LR的回收率可达81.0%。因此选择最佳洗脱次数为2次。

2.3方法验证

在最优条件下对方法性能指标进行评价，结果表明，MC-LR的质量浓度(x，μg/L)在0.25～146.5 μg/L范围内与其峰面积(y)呈良好线性，线性回归方程为y=1.403 6x+2.660 7，相关系数(r)为0.999 1。分别以S/N=3和S/N=10确定该方法的检出限(LOD)和定量下限(LOQ)，其中LOD为0.011 μg/L，LOQ为0.031 μg/L，低于目前使用的SPE/HPLC方法[21-22]。由于本方法的LOD及LOQ均远低于国家卫生标准规定的地表水源中微囊藻毒素允许的最高浓度(1 μg/L)，因此可实现环境水中痕量微囊藻毒素的准确定量分析。

2.4实际水样的应用

采用本方法，对取自吉林市松花江的水样进行萃取与分析，结果未检出微囊藻毒素。对该实际水样进行2.5，20，49.5 μg/L 3个浓度水平的加标回收实验，回收率分别为66.7%，69.9%和72.0%，相对标准偏差(RSD，n=3)分别为6.9%，3.5%和5.2%。该方法对10 mL 20 μg/L 的MC-LR加标实际水样的回收率约为70.0%。与纯水样中MC-LR的萃取结果相比，MC-LR的回收率略有下降，这是由于实际水样的基质复杂，其中无机盐类、杂质及有机物的存在影响了MC-LR在Fe3O4@ NiSiO3表面的吸附过程。

3　结　论

本文制备了一种磁性强、分散性好的新型复合磁性纳米粒子，将其作为固相萃取吸附剂用于水样中微囊藻毒素的萃取，并建立了水样中痕量微囊藻毒素检测的MSPE/HPLC技术。该方法具有有机溶剂用量少、富集倍数高、灵敏度高等优点，在水中痕量生物毒素的分析领域有着广阔的应用前景。

[1]Lian L L，Cao X L，Wu Y Q，Sun D Z，Lou D W.Appl.Surf.Sci.，2014，289：245-251.

[2]Pyo D，Moon D.Bull.KoreanChem.Soc.，2005，26(12)：2089-2092.

[3]Aranda-Rodriguez R，Jin Z Y，Harvie J，Cabecinha A.HarmfulAlgae，2015，42：34-42.

[4]Dai G F，Quan C Y，Zhang X Z，Liu J，Song L R，Gan N Q.WaterRes.，2012，46(5)：1482-1489.

[5]Ding G.AnhuiJ.Prevvent.Med.(丁刚.安徽预防医学杂志)，2010，16(1)：40-43.

[6]Wu K S，Xu H Y，Guo L，Liang Y Y，Xiong Y H.FoodSci.(吴科盛，许恒毅，郭亮，梁语嫣，熊勇华.食品科学)，2011，32(23)：317-320.

[7]Jiang C Z.ApplicationofMicro-extracationTechniqueinTreatmenttoEnvironmentalandMedicinalSamples.Changchun：Jilin University(姜春竹.微萃取技术在环境和药物样品处理中的应用.长春：吉林大学)，2013.

[8]Jiang C Z，Sun Y，Yu X，Gao Y，Zhang L，Wang Y P，Zhang H Q，Song D Q.Talanta，2013，114：167-175.

[9]Qing L S，Xue Y，Liu Y M，Liang J，Xie J，Liao X.J.Agric.FoodChem.，2013，61(34)：8072-8078.

[10]Lian L L，Cao X L，Wu Y Q，Lou D W.J.Instrum.Anal.(连丽丽，曹雪玲，吴玉清，娄大伟.分析测试学报)，2015，34(10)：1095-1100.

[11]Gong Z S，Ding G S，Tang A N.J.Instrum.Anal.(龚子珊，丁国生，唐安娜.分析测试学报)，2014，33(2)：231-238.

[12]Karatapanis A E，Fiamegos Y，Stalikas C D.Talanta，2011，84(3)：834-839.

[13]Rho W Y，Kim H M，Kyeong S，Kang Y L，Kim D H，Kang H，Jeong C，Kim D E，Lee Y S，Jun B H.J.Ind.Eng.Chem.，2014，20(5)：2646-2649.

[14]Wang H.Synthesis，AssemblyandApplicationofMagneticFe3O4/CCore-ShellNanoparticles.Hefei：University of Science and Technology of China(王辉.磁性Fe3O4/C核壳纳米粒子的合成、组装和应用.合肥：中国科技大学)，2011.

[15]Cheng C M.HunanAgric.Sci.(程春梅.湖南农业科学)，2014，6：7-9.

[16]Li J M，Shimizu K，Akasako H，Lu Z J，Akiyama S，Goto M，Utsumi M，Sugiura N.Bioresour.Technol.，2015，175：463-472.

[17]Westrick J A，Szlag D C，Southwell B A，Sinclair J.Anal.Bioanal.Chem.，2010，397：1705-1714.

[18]Zhao H，Qiu J B，Fan H，Li A F.J.Chromatogr.A，2013，1300：159-164.

[19]Zhong Q S，Hu Y F，Li G K，Hu Y L.Chin.J.Chromatogr.(钟启升，胡玉斐，李攻科，胡玉玲.色谱)，2009，27(5)：690-699.

[20]Sun H，Lou D W，Lian L L，Han X，Guo T X，Chen H J.Chin.J.Chromatogr.(孙红，娄大伟，连丽丽，韩雪，郭亭秀，陈慧君.色谱)，2015，33(5)：449-454.

[21]Hu X K，Feng B，Yang X S.Chin.J.HealthLab.Technol.(胡晓科，冯波，杨晓松.中国卫生检验杂志)，2015，25(11)：1699-1702.

[22]Feng G X，Liu L，Wang M Q，Sun S H，Jia R B.Chem.Anal.Meterage(冯桂学，刘莉，王明泉，孙韶华，贾瑞宝.化学分析计量)，2014，23(6)：34-36.

Extraction of Trace Microcystins in Water Using Fe3O4@NiSiO3

GUO Ting-xiu1,2，LOU Da-wei1*，LIAN Li-li1，WANG Xi-yue1，CHEN Hui-jun1,3，LI Qiu-ying1，WANG Run-nan1

(1.College of Chemistry and Pharmaceutical Engineering，Jilin Institute of Chemical Technology，Jilin132022，China;2.College of Chemistry，Northeast Normal University，Changchun130024，China;3.College of Chemistry，Jilin University，Changchun130012，China)

The Fe3O4@NiSiO3magnetic nanoparticles(NPs) were prepared by hydrothermal synthesis and sol-gel method.The nanoparticles microspheres have uniform morphology，good magnetic properties and dispersion.In this study，the synthesized NPs as a magnetic solid phase extraction(MSPE) media were combined with high performence liquid chromatography(HPLC) to develop an effective method for the detection of trace microcystin-LR(MC-LR) in water samples.After optimizing the MSPE and HPLC chromatographic conditions，the method showed a good linear relationship in the range of 0.25-146.5 μg/L with correlation coefficient(r) of 0.999 1.The detection limit was 0.011 μg/L.The method was applied in the analysis of microcystin toxins in pure water sample and actual water samples with recoveries of 81.0% and 66.7%-72.0%，respectively.The results showed that Fe3O4@NiSiO3magnetic nanoparticles have good enrichment capability，and could be effectively used for the extraction of trace microcystin in water.

magnetic solid-phase extraction(MSPE);high performance liquid chromatography(HPLC);microcystins(MCs);magnetic nanoparticles

2016-01-19；

2016-03-08

国家自然科学基金项目(21375046)；吉林省科技发展计划项目(20130521024JH,2013C041)；吉林省教育厅“十二五”科学技术研究项目(2013313)

娄大伟，博士，教授，研究方向：现代色谱分离分析方法及样品前处理技术，Tel：0432-63083163，E-mail：dwlou@hotmail.com

研究简报

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.09.011

O657.72;S852.44

A

1004-4957(2016)09-1137-05