绿原酸等四种物质采用不同进样方法制订HPLC标准曲线的比较

焦兴苹 昝珂 过立农++郑健 马双成

【摘要】目的：比较高效液相色谱法制作标准曲线时，对照品稀释法和不同进样量法的异同。方法：采用高效液相色谱法，以绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷对照品作为研究对象，采用对照品稀释法和进样不同体积法，测定峰面积，计算标准曲线。结果：木犀草苷两种方法结果线性关系良好，而绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷仅稀释法线性关系良好。结论：建议采用稀释法测定标准曲线，不同进样量法需慎重。

【关键词】高效液相色谱法；线性；对照品稀释法；不同进样量法

【中图分类号】R9141【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）18-0013-04

[JP2]在建立药品质量标准时，分析方法需经验证；在药品生产工艺变更、制剂的组分变更、原分析方法进行修订时，质量标准分析方法也需进行验证。线性是药品质量标准分析方法验证的必需项目之一[1]。在建立中药含量测定方法时，高效液相色谱法是最常采用的方法。常用的标准曲线制作方法有两种，一是配置一系列浓度的标准物质，以峰面积对被测物质浓度进行线性拟合[2-8]；另外一种方法是同一对照品溶液，进样不同体积，以峰面积对被测物质进样量（μg）进行线性回归计算[9-15]。本研究采用绿原酸（1）、连翘酯苷B（2）、毛蕊花糖苷（3）、木犀草苷（4）四个对照品（结构式见图1）按上述两种线性制作方法进行试验，比较二者的异同。结果显示，4个对照品溶液按照对照品稀释法试验，线性关系均良好；采用不同进样量法试验，仅木犀草苷线性关系良好，绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷三个化合物随进样量增大，峰面积响应值偏低，线性关系呈类抛物线型。[JP]

1仪器与材料

11仪器安捷伦1260型高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，二元泵，自动进样器，脱气机）；MSA125P型电子天平（赛多利斯）。

[JP2]12材料绿原酸对照品（批号：[KG-*3/5]110753-201314）、连翘酯苷B（批号：[KG-*3/5]111811-201102）、木犀草苷（批号：[KG-*3/5]111720-201408）购自中国食品药品检定研究院；毛蕊花糖苷（批号：[KG-*3/5]M-011-150318北京中科质检生物技术有限公司）。磷酸（批号20140305，国药集团化学试剂有限公司），甲醇和乙腈为色谱纯（Fisher公司），水为Milli-Q超纯水。[JP]

2方法和结果

21色谱条件色谱柱：Waters XSelect HSS T3（46mm×250mm，5μm）；流动相：乙腈-05%磷酸溶液 （18∶[KG-*3/5]82）；流速：10mL/min；柱温：25℃；检测波长：332nm。

22对照品溶液的配制分别取绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷和木犀草苷对照品约10mg，精密称定，分别置于10mL棕色量瓶中，以乙腈溶解并定容至10mL，即得各对照品储备液。分别吸取上述储备液01、02、03、05、08mL分别置于25mL容量瓶中，用流动相稀释至25mL，用045μm滤膜过滤，取续滤液，即得对照品溶液浓度分别约为4、8、12、20、32μg/mL。

23不同进样量法试验精密吸取22项下对照品混合溶液（20μg/mL），分别进样1、 2、 5、 10 、15μL，记录峰面积。以峰面积（Y）为纵坐标，以相应进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，结果见表1，线性图见图2。

结果表明，不同进样量法测定的木犀草苷线性关系良好，而绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷三个成分随进样量增大，响应值没有线性增加，呈类抛物线型。

23对照品稀释法测定线性分别精密吸取上述22项下一系列浓度的对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，按21项下色谱条件测定，以各对照品进样量（μg）为X轴，以峰面积积分值为Y轴，进行线性回归，各对照品回归方程和线性范围见表2，线性图见图3。

结果表明，采用对照品稀释法，所测四个成分线性关系均良好。

3结果与讨论

本实验采用高效液相色谱法，以绿原酸、连翘酯苷B、毛蕊花糖苷以及木犀草苷四个对照品为研究对象，通过对照品稀释法和进样不同体积法对质量标准分析方法验证中的线性进行试验。结果表明，采用对照品稀释法，四个化合物的线性关系均良好，采用进样不同体积法仅木犀草苷的线性关系良好，而绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷三个成分随进样量增大，峰面积响应值没有线性增加，呈类抛物线型。其原因可能是流动相中加入了磷酸溶液，对照品溶液为甲醇配制，随着进样量增大，注入的不同体积的对照品溶液对流动相的pH值造成了波动。

绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷结构中均含有咖啡酸酯类，在含水量较高的流动相中容易产生电离，使色谱峰拖尾变宽，加入磷酸等酸性抑制剂抑制了此类化合物的电离，改善色谱峰的峰形。流动相不同pH值对化合物的峰形具有显著影响，导致峰面积不完全成线性关系[16]。而进样相同体积不同浓度的对照品溶液对流动相pH值的影响是一致的，峰面积和浓度呈线性关系。

由于本实验仪器是采用自动进样，木犀草苷的线性均良好，表明进样器准确性和性能良好。实验选用的进样量范围1～15μL为常用进样量范围，进样体积并不过大。由于不同进样量法较为简便，课题组先采用不同进样量法进行线性试验，重复3次，结果均与本文报道一致，绿原酸、连翘酯苷B和毛蕊花糖苷3个化合物线性不佳，后改用稀释法进行试验，线性良好。

因此，进行中药质量标准验证时，标准曲线的制备一般应采用稀释法进行，慎重使用不同进样体积法。

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（编辑：梁志庆）