茶提取物和纳米表没食子儿茶素没食子酸酯对6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞保护作用

闫敬娜，罗理勇,2，胡雅琼,3，曾 亮,2,*

茶提取物和纳米表没食子儿茶素没食子酸酯对6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞保护作用

闫敬娜1，罗理勇1,2，胡雅琼1,3，曾 亮1,2,*

（1.西南大学食品科学学院，重庆 400715；2.西南大学茶叶研究所，重庆 400715；3.中国民生银行黄岩支行，浙江 台州 318020）

以6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）诱导的SH-SY5Y细胞系作为帕金森病（Parkinson’s disease，PD）体外细胞模型，探究茶提取物（L-茶氨酸、咖啡碱、茶多酚、表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）、茶黄素、茶色素）和两种纳米EGCG对SH-SY5Y细胞的毒性和对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用的差异，综合评价茶提取物治疗PD的潜力。结果表明：茶提取物毒性作用由弱到强为茶多酚＜L-茶氨酸＜茶色素＜咖啡碱＜茶黄素＜EGCG；保护作用由强到弱为茶黄素＞EGCG＞茶多酚＞茶色素＞咖啡碱＞L-茶氨酸；茶黄素（0.2 μg/mL）和EGCG（0.9 μg/mL）预处理6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞，细胞存活率分别为（99.59±2.24）%和（95.84±2.50）%，保护作用明显强于其他茶提取物；相较于EGCG，纳米EGCG具有毒性作用更弱和保护作用更强的特点。由此可知，茶作为一种日常饮品，具有较好地治疗PD的潜力。

帕金森病；茶提取物；6-羟基多巴胺；SH-SY5Y细胞；纳米表没食子儿茶素没食子酸酯

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是一种慢性进行性中枢神经系统退行性疾病，是仅次于阿尔茨海默病之后的第二大神经系统疾病，患者多为中老年人，尤其是60 岁以上的老人[1]。PD病程较长，致残率高，临床表现以静止性震颤、运动迟缓、肌强直及姿势平衡障碍为主要特征，还可能出现认知功能下降、情绪障碍等非运动症状[2]。目前PD的治疗手段包括药物、手术、细胞和基因治疗[2-3]，其中细胞和基因治疗尚处于实验阶段。手术治疗主要针对中晚期PD患者，采用脑深部电刺激法进行治疗，但有报道称这种方法可能产生认知功能减退的副作用[3]。药物治疗具有多靶点作用途径、毒性相对较小、安全性好等潜在优势，因而受到越来越多的重视[4]。PD的治疗药物分为缓解症状和神经保护两大类[3]，其中天然、高效的神经保护性药物开发已经成为国际PD治疗的研究热点[2]。

茶作为全球风靡的饮品之一，其消费量呈逐年增加的趋势。联合国粮食及农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）的数据显示，2010年全球茶叶消费量为400 万t，增长率为5.6%；我国作 为世界最大茶叶消费国，2006、2010、2013年茶叶消费量分别为74.48、106、161.32 万t[5-6]。茶含有丰富的生理活性物质，具有多种保健功能，如清除自由基、抗氧化、抗癌、抗诱变和抑菌等[7]。临床研究表明，饮茶能降低PD的发病率，对神经系统具有保护作用[8]；相较于其他神经保护性药物，茶的神经保护作用具有多途径、多靶点、低毒副作用和协同功效等优点[9]。

现已证实茶叶中的多种生理活性物质具有神经保护作用[10-12]，但其神经保护作用之间的差异性鲜见报道。此外，表没食子儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin-3-gallate，EGCG）在生物体内稳定性差、利用率低[13-14]；本实验室前期研究表明纳米EGCG较EGCG具有稳定性高、靶向性强、生物利用率高等优点[15]。本实验以6-羟基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系作为PD体外细胞模型[16-17]，比较6 种茶提取物（L-茶氨酸、咖啡碱、茶多酚、EGCG、茶黄素、茶色素）和纳米EGCG对SH-SY5Y细胞毒性作用和对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用的差异，综合评价茶提取物治疗PD的潜力，筛选出高效、低毒副作用的茶叶功能性物质。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞系 中国科学院细胞库；DMEM培养基、胎牛血清、Hank’s平衡盐溶液（Hank’s balanced salt solution，HBSS） 美国Gibco公司；胰蛋白酶、杜氏磷酸缓冲盐（phosphate buffered saline，PBS） 美国HyClone公司；4-羟乙基哌嗪乙磺酸（4-(2-hydroxyerhyl) piperazine-1-erhaesulfonic acid，HEPES）、牛胰岛素、亚甲基蓝、戊二醛、L-茶氨酸（纯度＞98%）、咖啡碱（纯度＞98%） 美国Sigma公司；青链霉素混合液（双抗） 北京鼎国生物技术有限责任公司；儿茶素（catechin，C）、表儿茶素（epicatechin，EC）、表没食子儿茶素（epigallocatechin，EGC）、表儿茶素没食子酸酯（epigallocatechin gallate，ECG）、没食子儿茶素没食子酸酯（(−)-gallocatechingallate，GCG）、茶黄素（theaflavin，TF1）、茶黄素-3-没食子酸酯（theaflavin-3-gallate，TF-3G）、茶黄素-3’-没食子酸酯（theaflavin-3’-gallate，TF-3’G）、茶黄素双没食子酸酯（theaflavin-3,3’-digallate，TFDG） 成都普瑞法科技开发有限公司；茶多酚（纯度＞99.5%）、EGCG（纯度＞95%）、茶黄素（纯度为54.017%，其中TF1含量为8.248%、TF-3G含量为11.438%、TF-3’G含量为5.062%、TFDG含量为29.269%） 长沙华诚生物科技有限公司；壳聚糖（chitosan，CS） 浙江奥兴生物技术有限公司；叶酸（folic acid，FA）、三聚磷酸钠（sodium tripolyphosphate，TPP） 上海晶纯生化科技股份有限公司；甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酸酯（methoxypolyethyleneglycol-succinimidyl-propionic acid ester，mPEG-SPA）、NH2-PEG-COOH 嘉兴博美生物技术有限公司；普洱熟茶经典系列7572 大益茶业集团。

纳米EGCG（实验室自制）[18]：以CS、TPP为载体，并以FA和聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）作靶向性修饰，采用离子凝胶技术制备两种纳米EGCG，即（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2。

茶色素（实验室自制）：普洱熟茶7572以茶水比1∶20（m/V）的沸水浸提10 min，趁热过滤，冷却至室温。滤液以水-乙醇为洗脱液，过大孔树脂进行梯度洗脱，收集目标产物茶色素，冷冻干燥，－80 ℃条件下储存备用。经检测茶色素主要成分包括C（0.98%）、EC（3.31%）、EGC（6.67%）、ECG（0.56%）、EGCG（0.98%）、没食子酸（43.48%）、咖啡碱（4.86%）、氨基酸（3.12%）、可溶性糖（10.55%）。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-2FDA超洁净细胞实验工作台 美国Airtech公司；3111 CO2恒温培养箱、LEGEND MACH 1.6R离心机、MULTISKAN GO酶标仪 美国Thermo Scientific公司；倒置显微镜 日本Nikon公司；MX100-4A微孔板振荡器 杭州奥盛仪器有限公司；PWC124分析天平（0.1 mg级） 上海京工实业有限公司；TOMY ES-315高压蒸汽灭菌锅 上海艾高德生物科技有限公司；85-2A磁力搅拌器 金坛市精达仪器制造厂；FD-1A-50真空冷冻干燥机 深圳迈瑞医疗国际股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 SH-SY5Y细胞培养[19]

SH-SY5Y细胞以高糖DMEM培养基（含10%胎牛血清、100 μg/mL链霉素、100 μg/mL青霉素）为细胞生长所需的完全培养基，无菌条件下，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养，2 d更换一次培养液，每3～5 d传代一次。

1.3.2 PD体外细胞模型的建立[20-21]

取对数生长期SH-SY5Y细胞接种到96 孔板中，细胞浓度调节为1×105个/mL，无菌条件下，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养8～16 h，至细胞完全贴壁后，移除培养基。实验组分别加入100 μL含不同浓度（10、50、100、150、200、300 μmol/L）6-OHDA的完全培养基，空白组仅添加完全培养基，于培养箱中培养24 h。培养结束后，采用亚甲基蓝染色法检测细胞存活率，并通过倒置显微镜观察细胞形态的变化。

1.3.3 茶提取物和纳米EGCG对SH-SY5Y细胞的毒性作用[20-21]

具体方法同1.3.2节。实验组分别加入100 μL不同质量浓度的茶提取物，分别为5、18、90、175、350 μg/mL的L-茶氨酸；2、10、20、40、80、200 μg/mL的咖啡碱；0.2、2、10、25、50、100 μg/mL的茶黄素；10、50、100、200、300、500 μg/mL的茶色素；10、50、100、200、500、1000 μg/mL的茶多酚；0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL的EGCG；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2载有的EGCG质量浓度为0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL，空白组仅添加完全培养基。采用亚甲基蓝染色法检测细胞存活率。当细胞存活率≥90%时说明样品对细胞无毒性作用，反之则对细胞有毒性作用。

1.3.4 茶提取物和纳米EGCG对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用[20-21]

以1×105个/mL浓度接种对数生长期的SH-SY5Y细胞于96 孔板中，无菌条件下，于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养8～16 h，至细胞完全贴壁后，移除培养基。分为3 组：空白组、对照组和实验组。实验组添加100 μL含不同质量浓度茶提取物或纳米EGCG的完全培养基，空白组和对照组分别添加100 μL完全培养基，于培养箱中培养3 h。培养结束后，移除培养基，实验组和对照组添加100 μL含100 μmol/L 6-OHDA的完全培养基，空白组添加100 μL完全培养基，于培养箱中继续培养3 h。培养结束后，采用亚甲基蓝染色法检测细胞存活率。

茶提取物的质量浓度分别为：5、18、90、175、 350 μg/mL L-茶氨酸；2、10、20、40、80 μg/mL咖啡碱；0.2、2、10、25、50 μg/mL茶黄素；10、50、100、200、300 μg/mL茶色素；10、50、100、200、500 μg/mL茶多酚；0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL EGCG；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2载有的EGCG质量浓度为0.09、0.9、2.3、14、45、70、140 μg/mL。

1.3.5 亚甲基蓝染色法检测细胞存活率[22]

取经样品处理后的 细胞悬液，移除培养基，并用PBS漂洗。每孔加入50 μL亚甲基蓝溶液（含有0.6%亚甲基蓝和1.25%戊二醛的HBSS），于培养箱中培养1 h对细胞进行染色。染色完毕后，去除亚甲基蓝溶液，并用超纯水漂洗干净。每孔加入100 μL洗脱液（含有50%乙醇、49% PBS和1%乙酸），室温条件下将96 孔板放置在水平摇床上保持20 min，至细胞完全溶解。采用酶标仪（570 nm）检测每孔光密度（OD570nm）值，按照下式计算不同样品处理后的细胞存活率。

1.4 数据处理

每个样品均设3 次重复。表和图中数据均表示为±s，方差分析和差异性分析（P＜0.05）采用SPSS 19.0软件进行运算，处理间平均值的比较用最小显著差异法。

2 结果与分析

2.1 不同浓度6-OHDA对SH-SY5Y细胞的影响

采用不同浓度6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞24 h，筛选出建立PD体外细胞模型的最佳6-OHDA诱导浓度。由图1可知，随着6-OHDA浓度的增大，SH-SY5Y细胞存活率降低，且呈明显的剂量依赖性；经计算分析可知IC50为128.95 μmol/L。由图2可知，空白组（6-OHDA浓度为0 μmol/L）的SH-SY5Y细胞生长良好，呈扁平多边形或梭形，细胞数量较多；随着6-OHDA浓度增大，SH-SY5Y细胞皱缩，呈圆形或椭圆形，细胞数量逐渐减少。有文献报道6-OHDA诱导的PD体外细胞模型研究中，SH-SY5Y细胞存活率一般为30%～66%[16,21,23-24]。Guo Shuhong[20]和Tian[21]等在研究过程中采用100 μmol/L 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞构建PD体外研究模型时，其存活率分别为30%、35%；Lopes[16]和王莉莉[25]等在研究过程中分别采用35、15、100 μmol/L 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞构建PD体外研究模型时，其细胞存活率为50%；Tiong等[23]在研究过程中采用50 μmol/L 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞构建PD体外研究模型时，其细胞存活率约为58%。本实验选取了0、10、50、100、150、200、300 μmol/L 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞24 h，其中100 μmol/L 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞24 h后细胞存活率为（59.75±1.32）%（图1），且细胞形态基本正常，呈扁平多边形或梭形（图2C）。因此后续的实验采用100 μmol/L 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞构建PD体外研究模型。

图1 不同浓度6-OHDA对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig.1 Effect of different concentrations of 6-OHDA on SH-SY5Y cell viability

图2 不同浓度6-OHDA对SH-SY5Y细胞形态的影响Fig.2 Morphology of SH-SY5Y cells treated with 6-OHDA

2.2 茶提取物和纳米EGCG对SH-SY5Y细胞的毒性作用

采用不同质量浓度的茶提取物和纳米EGCG处理SH-SY5Y细胞24 h，确定其对SH-SY5Y细胞无毒性剂量范围，以此作为SH-SY5Y细胞氧化损伤保护剂量范围。如图3所示，茶提取物和纳米EGCG对SH-SY5Y细胞的无毒性剂量范围分别是：L-茶氨酸，0～350 μg/mL；咖啡碱，0～80 μg/mL；茶黄素，0～50 μg/mL；茶色素，0～300 μg/mL；茶多酚，0～500 μg/mL；EGCG，0～45 μg/mL；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2，0～140 μg/mL。由此可知，茶提取物对SH-SY5Y细胞的毒性作用由弱到强为茶多酚＜L-茶氨酸＜茶色素＜咖啡碱＜茶黄素＜EGCG；纳米EGCG对SH-SY5Y细胞的毒性作用较EGCG弱。

图3 茶提取物和纳米EGCG对SH-SY5Y细胞存活率的影响Fig.3 Effect of different tea extracts on SH-SY5Y cell viability

L-茶氨酸是茶叶中特有的一种氨基酸，占茶叶干质量的1%～2%[26]。L-茶氨酸具有多种生理功能，如使人情绪稳定和注意力集中、提高学习和记忆能力、抗疲劳、降血压、抑制由谷氨酸引起的大鼠皮质神经元死亡、促进神经系统的成熟、帮助完善大脑功能等[27]。本实验结果表明，L-茶氨酸对SH-SY5Y细胞的无毒性剂量范围是0～350 μg/mL。van der Pijl等[28]报道人体饮用含100 mg L-茶氨酸的茶，血浆中L-茶氨酸质量浓度将在50 min后达到最大值，为4.4 μg/mL，由此推测，人体血浆中L-茶氨酸质量浓度为350 μg/mL，需饮用含7.95 g L-茶氨酸的茶。已有报道显示，茶氨酸的半数致死量（LD50）＞5 g/kg（小鼠，18～20 g）[29]和最大耐受剂量为4 g/kg（大鼠，172～226 g）[30]，根据人与动物间按体表面积折算的等效剂量比值表可知，人体内L-茶氨酸半数致死量和最大耐受剂量分别为37 g和29.7 g，远远大于本实验中最大无毒性剂量所需食用的L-茶氨酸量（7.95 g）。此外，我国国家卫生和计划生育委员会通过2014年15号公告批准茶叶氨基酸为新食品原料[31]；日本已经确认L-茶氨酸为安全物质，在使用中不作限制用量规定[27,29]。茶多酚是一类存在于茶树中的多元酚混合物，其主要成分是儿茶素（约占70%～80%）[26]；经检测本实验所用茶多酚的主要成分包括EGCG（47.3%）、EC（1.78%）、ECG（11.75%）、EGC（5.15%）、GCG（3.48%）。Guo Shuhong等[20]在研究中发现，EGCG、ECG、EC均能提高SH-SY5Y细胞存活率，其中ECG浓度为400 μmol/L（177 μg/mL）时，细胞存活率达到170%；本实验结果表明，茶多酚对SH-SY5Y细胞的最大无毒性剂量为500 μg/mL，其内含EGCG、ECG的质量浓度分别为236.5、58.75 μg/mL；EGCG单独作用于SH-SY5Y细胞时，最大无毒性剂量为45 μg/mL。由此推测，茶多酚对SH-SY5Y细胞的毒性作用弱，是由于EGCG、ECG或其他物质的协同作用减弱了毒性作用。茶色素是从普洱熟茶7572中提取的一种混合物，其主要成分是没食子酸（43.48%）。Lu Zhongbing等[32]的研究表明，没食子酸单独作用于SH-SY5Y细胞的无毒性剂量范围为0～150 μmol/L（即0～25.5 μg/mL）。本实验结果表明，茶色素对SH-SY5Y细胞的最大无毒性剂量为300 μg/mL，其内含没食子酸质量浓度为130.44 μg/mL，远远大于没食子酸单独作用的无毒性剂量范围；咖啡碱、EGCG、ECG的质量浓度分别为14.58、2.94、1.68 μg/mL，均处于无毒性剂量范围内，且有增大细胞存活率的趋势（图3）。由此推测，茶色素对SH-SY5Y细胞的毒性作用弱是由于没食子酸、咖啡碱、EGCG和ECG的协同作用减弱了毒性作用。

本实验中，EGCG质量浓度为140 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（59.93±4.30）%，EGCG表现出了明显的毒性作用；相同EGCG质量浓度下，FA和PEG修饰的纳米EGCG（FA约为30 μg/mL）对SH-SY5Y细胞没有毒性作用。Budni等[33]研究表明，FA单独作用于SH-SY5Y细胞的无毒性剂量范围为1～300 μmol/L（即0～132 μg/mL），且1 μmol/L FA作用于SH-SY5Y细胞时，细胞存活率约为110%。张景燕等[34]也曾报道经FA处理的SH-SY5Y细胞存活率是对照组的1.45 倍。由此推测，纳米EGCG对SH-SY5Y细胞的毒性作用较EGCG弱，是因为FA和EGCG的协同作用减弱了毒性作用。为了在相同EGCG质量浓度范围内，比较EGCG与纳米EGCG对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用的差异，在后续实验中EGCG与纳米EGCG的剂量均采用0～140 μg/mL。

2.3 茶提取物和纳米EGCG对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用

采用不同质量浓度的茶提取物和纳米EGCG处理SH-SY5Y细胞3 h，再经6-OHDA 诱导3 h，评价茶提取物和纳米EGCG对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用。由图4可知，经茶提取物或纳米EGCG预处理的SH-SY5Y细胞存活率显著高于对照组的SH-SY5Y细胞存活率，表明茶提取物和纳米EGCG对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞具有一定的保护作用，可显著抑制6-OHDA对SH-SY5Y细胞的毒性作用。随着茶提取物质量浓度的增大，SH-SY5Y细胞存活率呈现先上升后下降的趋势，并未表现出明显的剂量依赖性。当低于细胞存活率最大值对应的质量浓度时，茶提取物或纳米EGCG对SH-SY5Y细胞的保护作用随着质量浓度的增大而增强；高于此质量浓度时，保护作用随着质量浓度的增大而减弱。已有的神经保护性药物研究如钩藤提取物[35]、黄苓素[36]、槲皮素[37]、侧柏乙醇提取物[24]也有相似的趋势。由图4可知，茶黄素 质量浓度为50 μg/mL和EGCG质量浓度＞70 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率等于或者小于对照组的SH-SY 5Y细胞存活率， 说明高于 一定质量浓度，茶提取物或纳米EGCG会加重6-OHDA对SH-SY5Y细胞的毒性作用。王莉莉等[25]在研究中也发现，高浓度EGCG（20～400 μmol/L）加重了6-OHDA对SH-SY5Y细胞的损害作用，导致细胞存活率（对照组15.3%～21.4%）下降。

图4 茶提取物和纳米EGCG对6-OHDA诱导的SH-SYY55YY细胞存活率的影响Fig.4 Effect of different tea extracts on 6-OHDA-induced SH-SY5Y cell viability

由图4可知，不同茶提取物和纳米EGCG预处理6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞，其细胞存活率最大值不同，分别表现为：L-茶氨酸质量浓度为350 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（86.38±3.17）%；咖啡碱质量浓度为40 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（86.78±2.04）%；茶黄素质量浓度为0.2 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（99.59±2.24）%；茶色素质量浓度为200 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（92.92±2.47）%；茶多酚质量浓度为100 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（94.92±2.76）%；EGCG质量浓度为0.9 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（95.84±2.50）%；（FA+PEG）-EGCG-NPs-1质量浓度为0.9 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（103.40±2.16）%；（FA+PEG）-EGCG-NPs-2质量浓度为2.5 μg/mL时，SH-SY5Y细胞存活率为（104.17±4.30）%。由此可知，茶提取物对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用由强到弱为：茶黄素＞EGCG＞茶多酚＞茶色素＞咖啡碱＞L-茶氨酸；纳米EGCG和EGCG对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用由强到弱为（FA+PEG）-EGCG-NPs-2≥（FA+PEG）-EGCG-NPs-1＞EGCG。Owen等[38]的研究表明，L-茶氨酸和咖啡碱的共同作用有利于改善人的认知能力；Horie等[39]也曾报道，EC和EGCG的协同作用能够诱导胃癌细胞株MKN-45细胞的凋亡。由此推测，茶对SH-SY5Y细胞以及神经系统的保护作用是多种茶提取物协同作用的结果。

已研究的神经保护性药物如钩藤提取物[35]、黄芩素[36]、槲皮素[37]和侧柏乙醇提取物[24]预处理6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞，细胞存活率最大值分别为79%、82%、80%、82%，其所对应的药物质量浓度分别为200、3.4、15.1、10 μg/mL。本实验中，茶提取物预处理6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞，其细胞存活率最大值可达（86.38±3.17）%～（99.59±2.24）%，表明茶提取物对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用较强；且达到细胞存活率最大值对应的茶黄素质量浓度（0.2 μg/mL）和EGCG质量浓度（0.9 μg/mL）远远低于其他茶提取物和神经保护药物的质量浓度，说明茶黄素和EGCG具有较强的神经保护作用。此外，茶黄素和EGCG是茶叶中常见且量大的功能性成分，可以通过饮茶的方式快速、便捷获取这些茶叶活性物质。

本实验中，纳米EGCG实验组SH-SY5Y细胞存活率最大值略高于EGCG实验组，而且在高质量浓度下，纳米EGCG实验组SH-SY5Y细胞存活率下降速率较EGCG实验组慢，这可能与FA对SH-SY5Y细胞的保护作用有关[33-34]，FA与EGCG的协同作用使纳米EGCG较EGCG具有更强的保护作用。本实验室在研究不同修饰纳米EGCG对人乳腺癌MCF-7细胞的影响中发现，FA的靶向性作用增强了纳米EGCG的抗增殖能力，FA和PEG的协同作用促进了纳米EGCG的抗肿瘤属性[18]。由此推测，FA的靶向性作用、FA和PEG的协同作用也是导致纳米EGCG较EGCG具有更强神经保护作用的原因。由图4可知，两种纳米EGCG对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用也有差异。SH-SY5Y细胞存活率达到最大值时，（FA+PEG）-EGCG-NPs-1和（FA+PEG）-EGCG-NPs-2的质量浓度分别为0.9 μg/mL和2.5 μg/mL，这可能是两种纳米EGCG的制备方式不同导致的。（FA+PEG）-EGCG-NPs-1的制备是采用离子交联法形成EGCG-NPs，将FA和PEG枝接到EGCG-NPs上；（FA+PEG）-EGCG-NPs-2的制备是将FA和PEG枝接到壳聚糖上形成FA-PEG-CS，再采用离子交联法使FA-PEG-CS与TPP、EGCG形成（FA+PEG）-EGCG-NPs-2[18]。

3 结 论

SH-SY5Y细胞是一种分化程度较低的肿瘤细胞，与正常神经细胞具有相似的细胞形态和生理生化特征，现已被广泛应用于神经系统的发病机制和药物筛选研究[40]。6-OHDA是神经递质多巴胺的羟基化衍生物，作用于多巴胺能神经元导致神经细胞变性、死亡，黑质-纹状体多巴胺系统功能减退，产生类似帕金森病的症状[40]。6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞是较成熟的PD体外细胞模型[16-17]。本实验中采用100 μmol/L 6-OHDA诱导SH-SY5Y细胞制备PD体外细胞模型，细胞存活率为（59.75±1.32）%，细胞形态基本正常，呈扁平多边形或梭形。

研究表明，低质量浓度茶提取物对SH-SY5Y细胞没有毒性作用； 高质量浓度茶提取物对SH-SY5Y细胞表现出毒性作用。在茶提取物对SH-SY5Y细胞无毒性剂量范围内，研究茶提取物对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用，发现茶黄素对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用最强，其次为EGCG、茶多酚、茶色素、咖啡碱、L-茶氨酸。低质量浓度EGCG和茶黄素预处理6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞，细胞存活率≥95%，其保护作用明显强于其他茶提取物及已研究的神经保护性药物[24,35-36]，表明EGCG和茶黄素具有较好的治疗PD潜力。EGCG是绿茶的主要成分，约占绿茶干质量的9%～13%；茶黄素是红茶的主要成分，约占红茶干质量的1%～3%[26]，由此可推断常饮绿茶和红茶对神经保护有一定的功效。茶作为三大无醇饮料之一，在中国产量大、价格较低，且是一种方便快捷、易获得的饮品，这为以茶为原材料的神经保护功能食品的开发提供了便利性。

本实验中经FA和PEG修饰的纳米EGCG较EGCG具有较低的细胞毒性和更好的细胞保护作用。已有的研究表明，纳米EGCG较EGCG具有生物活性高、生物利用率高和细胞内靶向性强等优点[15]。纳米EGCG为高效低毒副作用的神经保护性药物开发提供了新途径，但将其应用于动物实验或临床实验的效果还需要进一步探究。茶黄素是一类具有苯并卓酚酮结构的化合物的总称[26]，但各茶黄素单体对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞的保护作用和协同作用尚待研究。不同茶提取物对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞具有不同程度的保护作用，且不同的茶类中所富含的这些功能成分（茶提取物）含量不同，因此在后续实验中还将研究不同的茶类对6-OHDA诱导的SH-SY5Y细胞保护作用，为茶在神经保护作用方面的进一步开发利用提供基础数据。

[1] SHEARD J M, ASH S, SILBURN P A, et al. Prevalence of malnutrition in Parkinson’s disease: a systematic review[J]. Nutrition Reviews, 2011, 69(9): 520-532. DOI:10.1111/j.1753-4887.2011.00413.x.

[2] 张丽娟, 邵海涛, 王跃秀, 等. 帕金森病研究进展[J]. 生命科学, 2014, 26(6): 560-570. DOI:10.13376/j.cbls/2014081.

[3] 毕涌, 张旭. 帕金森病的治疗进展[J]. 临床内科杂志, 2011, 28(12): 807-810. DOI:10.3969/j.issn.1001 9057.2011.12.004.

[4] 陈生弟, 王刚, 刘军, 等. 帕金森病发病机制与诊治的基础与临床研究进展[J]. 上海交通大学学报(医学版), 2012, 32(9): 1221-1226. DOI:10.3969/j.issn.1674-8115.2012.09.019.

[5] Food and Agriculture Organization (2014). Firm tea prices set to continue[EB/OL]. (2014-10) [2015-04-05]. http://www.fao.org/news/ story/en/item/124221/icode/.

[6] 管曦, 杨江帆. 基于二阶段的中国茶叶消费行为分析[J]. 中国茶叶, 2015(2): 9-10.

[7] 何小维, 王雪霞, 许文玲. 浅谈茶的保健功能及茶保健品的发展现状[J]. 农产品加工(学刊), 2006 (4): 62-64. DOI:10.3969/j.issn.1671-9646-B.2006.04.021.

[8] 刘丹, 蒋知新, 张清华, 等. 帕金森病与饮茶的病例对照研究[J].中华神经医学杂志, 2004, 3(3): 181-184. DOI:10.3760/cma. j.issn.1671-8925.2004.03.007.

[9] 李大祥, 鲜殊, 杨卫, 等. 茶叶的神经保护作用研究进展[J]. 茶叶科学, 2011, 31(2): 79-86.

[10] 李巍巍, 李俊发, 郭安臣, 等. 植物多酚神经保护作用的研究进展[J]. 中国卒中杂志, 10(2): 141-146. DOI:10.3969/ j.issn.1673-5765.2015.02.008.

[11] ANANDHAN A, TAMILSELVAM K, RADHIGA T, et al. Theaflavin, a black tea polyphenol, protects nigral dopaminergic neurons against chronic MPTP/probenecid induced Parkinson’s disease[J]. Brain Research, 2012, 1433: 104-113. DOI:10.1016/j.brainres.2011.11.021.

[12] KAKUDA T. Neuroprotective effects of the green tea components theanine and catechins[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2002, 25(12): 1513-1518. DOI:10.1248/bpb.25.1513.

[13] SIDDIQUI I A, ADHAMI V M, BHARALI D J, et al. Introducing nanochemoprevention as a novel approach for cancer control: proof of principle with green tea polyphenol epigallocatechin-3-gallate[J]. Cancer Research, 2009, 69(5): 1712-1716. DOI:10.1158/0008-5472. CAN-08-3978.

[14] HENNING S M, NIU Y, LEE N H, et al. Bioavailability and antioxidant activity of tea flavanols after consumption of green tea, black tea, or a green tea extract supplement[J]. American Journal of Clinical Nutrition, 2004, 80(6): 1558-1564.

[15] 温旭烨. 茶叶提取物及纳米 EGCG对人乳腺癌MCF-7细胞生长增殖的影响[D]. 重庆: 西南大学, 2014: 5-12.

[16] LOPES F M, SCHRÖDER R, da FROTA JÚNIOR M L C, et al. Comparison between proliferative and neuron-like SH-SY5Y cells as an in vitro model for Parkinson disease studies[J]. Brain Research, 2010, 1337: 85-94. DOI:10.1016/j.brainres.2010.03.102.

[17] 冯波, 王蓉, 盛树力. 神经退行性疾病研究中拟神经细胞模型: 人神经母细胞瘤株SH-SY5Y的来源特性及应用[J]. 中国临床康复, 2006, 10(6): 121-123. DOI:10.3321/j.issn:1673-8225.2006.06.054.

[18] 蒋洁琳. 纳米EGCG制备及其对MCF-7肿瘤细胞的抑制功效评价[D].重庆: 西南大学, 2013: 2-19.

[19] 吴波拉, 虞希冲, 杜冠华. L-茶氨酸减轻叠氮钠诱导的人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞线粒体损伤[J]. 基础医学与临床, 2013, 33(11): 1465-1469.

[20] GUO S, BEZARD E, ZHAO B. Protective effect of green tea polyphenols on the SH-SY5Y cells against 6-OHDA induced apoptosis through ROS-NO pathway[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2005, 39(5): 682-695. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2005.04.022.

[21] TIAN L L, ZHOU Z, ZHANG Q, et al. Protective effect of (±) isoborneol against 6-OHDA-induced apoptosis in SH-SY5Y cells[J]. Cellular Physiology and Biochemistry, 2007, 20(6): 1019-1032. DOI:10.1159/000110682.

[22] FELICE D L, SUN J, LIU R H. A modified methylene blue assay for accurate cell counting[J]. Journal of Functional Foods, 2009, 1(1): 109-118. DOI:10.1016/j.jff.2008.09.014.

[23] TIONG C X, LU M, BIAN J S. Protective effect of hydrogen sulphide against 6-OHDA-induced cell injury in SH-SY5Y cells involves PKC/ PI3K/Akt pathway[J]. British Journal of Pharmacology, 2010, 161(2): 467-480. DOI:10.1111/j.1476-5381.2010.00887.x.

[24] JU M S, LEE P, KIM H G, et al. Protective effects of standardized Thuja orientalis leaves against 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity in SH-SY5Y cells[J]. Toxicology in Vitro, 2010, 24(3): 759-765. DOI:10.1016/j.tiv.2009.12.026.

[25] 王莉莉, 徐胜利, 陈彪. 表没食子儿茶素没食子酸酯对6-OHDA导致的多巴胺能神经细胞损伤的保护作用[J]. 中国行为医学科学, 2007, 16(4): 311-314. DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-6554.2007.04.008.

[26] 宛晓春, 茶叶生物化学[M]. 北京: 中国农业出版社, 2006: 26-53.

[27] 帅玉英, 张涛, 江波, 等. 茶氨酸的研究进展[J]. 食品与发酵工业, 2009, 34(11):117-123.

[28] van der PIJL P C, CHEN L, MULDER T P J. Human disposition of L-theanine in tea or aqueous solution[J]. Journal of Functional Foods, 2010, 2(4): 239-244. DOI:10.1016/j.jff.2010.08.001.

[29] JUNEJA L R, CHU D C, OKUBO T, et al. L-theanine: a unique amino acid of green tea and its relaxation effect in humans[J]. Trends in Food Science & Technology, 1999, 10(6): 199-204. DOI:10.1016/S0924-2244(99)00044-8.

[30] BORZELLECA J F, PETERS D, HALL W. A 13-week dietary toxicity and toxicokinetic study with L-theanine in rats[J]. Food and Chemical Toxicology, 2006, 44(7): 1158-1166. DOI:10.1016/j.fct.2006.03.014.

[31] 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会. 关于批准茶叶茶氨酸为新食品原料等的公告(2014年 第15号)[EB/OL]. (2014-07-18) [2015-04-20]. http://www.moh.gov.cn/sps/s7890/201407/d388b72707 fa4e978bea6a222b920cbf.shtml.

[32] LU Z B, NIE G, BELTON P S, et al. Structure-activity relationship analysis of antioxidant ability and neuroprotective effect of gallic acid derivatives[J]. Neurochemistry International, 2006, 48(4): 263-274. DOI:10.1016/j.neuint.2005.10.010.

[33] BUDNI J, ROMERO A, MOLZ S, et al. Neurotoxicity induced by dexamethasone in the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line can be prevented by folic acid[J]. Neuroscience, 2011, 190: 346-353. DOI:10.1016/j.neuroscience.2011.05.053.

[34] 张景燕, 陈娟, 王蓉, 等. 叶酸和维生素B12对人神经母细胞瘤株SH-SY5Y细胞的保护作用[J]. 首都医科大学学报, 2013, 33(6): 776-778. DOI:10.3969/j.issn.1006-7795.2012.06.014.

[35] SHI Z H, LU Z B, ZHAO Y S, et al. Neuroprotective effects of aqueous extracts of uncaria tomentosa: insights from 6-ohda induced cell damage and transgenic Caenorhabditis elegans model[J]. Neurochemistry International, 2013, 62(7): 940-947. DOI:10.1016/ j.neuint.2013.03.001.

[36] LEE H J, NOH Y H, KIM Y S, et al. Baicalein attenuates 6-hydroxydopamine-induced neurotoxicity in SH-SY5Y cells[J]. European Journal of Cell Biology, 2005, 84(11):897-905. DOI:10.1016/j.ejcb.2005.07.003.

[37] OSSOLA B, KÄÄRIÄINEN T M, RAASMAJA A, et al. Timedependent protective and harmful effects of quercetin on 6-OHDA-induced toxicity in neuronal SH-SY5Y cells[J]. Toxicology, 2008, 250(1): 1-8. DOI:10.1016/j.tox.2008.04.001.

[38] OWEN G N, PARNELL H, de BRUIN E A, et al. The combined effects of L-theanine and caffeine on cognitive performance and mood[J]. Nutritional Neuroscience, 2008, 11(4): 193-198. DOI:10.1179/147683008X301513.

[39] HORIE N, HIRABAYASHI N, TAKAHASHI Y, et al. Synergistic effect of green tea catechins on cell growth and apoptosis induction in gastric carcinoma cells[J]. Biological and Pharmaceutical Bulletin, 2005, 28(4): 574-579. DOI:10.1248/bpb.28.574.

[40] 王丹萍. 6-羟基多巴 胺诱导的SH-SY5Y细胞帕金森病模型差异蛋白质组学研究[D]. 长春: 吉林大学, 2010: 3-9.

Protective Effects of Tea Extracts and Nano-EGCG against 6-OHDA-Induced Cell Injury in SH-SY5Y Cells

YAN Jingna1, LUO Liyong1,2, HU Yaqiong1,3, ZENG Liang1,2,*
(1. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China; 2. Tea Research Institute, Southwest University, Chongqing 400715, China; 3. Huangyan Branch of China Minsheng Bank, Taizhou 318020, China)

Human neuroblastoma cell line SH-SY5Y challenged with 6-hydroxydopamine (6-OHDA) was used as an in vitro model of Parkinson’s disease (PD), and the cytotoxicity of tea extracts including L-theanine, caffeine, tea polyphenol, epigallocatechin-3-gallate (EGCG), theaflavins, tea pigment, and two kinds of nano-EGCG on SH-SY5Y cells were investigated, and their protective effects on 6-OHDA-induced SH-SY5Y cells were compared to evaluate their potentials for the treatment of PD. The results showed that the cytotoxicity was in the following order: tea polyphenol ＜ L-theanine ＜tea pigment ＜ caffeine ＜ theaflavins ＜ EGCG; the protective effects were in the following order: theaflavins ＞ EGCG ＞ tea polyphenol ＞ tea pigment ＞ caffeine ＞ L-theanine. Theaflavins (0.2 μg/mL) and EGCG (0.9 μg/mL) were more effective than other tea extracts in preventing SH-SY5Y cells from 6-OHDA-induced damage, restoring cell viability to (99.59 ± 2.24)% and (95.84 ± 2.50)%, respectively. Compared to EGCG, nano-EGCG had weaker cytotoxicity and stronger protective effect. Based on our results, tea, as a natural daily drink, has better potential for the treatment of PD.

Parkinson’s disease (PD); tea extracts; 6-hydroxydopamine (6-OHDA); SH-SY5Y cell; nano-epigallocatechin-3-gallate

10.7506/spkx1002-6630-201601029

TS218

A

1002-6630（2016）01-0163-08

闫敬娜, 罗理勇, 胡雅琼, 等. 茶提取物和纳米表没食子儿茶素没食子酸酯对6-羟基多巴胺诱导的SH-SY5Y细胞保护作用[J]. 食品科学, 2016, 37(1): 163-170. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201601029. http:// www.spkx.net.cn

YAN Jingna, LUO Liyong, HU Yaqiong, et al. Protective effects of tea extracts and nano-EGCG against 6-OHDA-induced cell injury in SH-SY5Y cells[J]. Food Science, 2016, 37(1): 163-170. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/ spkx10 02-6630-201601029. http://www.spkx.net.cn

2015-05-28

国家自然科学基金青年科学基金项目（31100500）；重庆市科委自然科学基金计划项目（CSTC,2013jcyjA80021）；

中央高校基本科研业务费专项资金项目（XDJK2013B036）

闫敬娜（1988—），女，硕士研究生，主要从事茶资源综合利用研究。E-mail：308703119@qq.com

*通信作者：曾亮（1980—），女，副教授，博士，主要从事茶资源综合利用研究。E-mail：zengliangbaby@126.com