一株油茶炭疽病病原拮抗细菌的分离与鉴定

吴天乐， 陈 艺， 马 力， 曾粮斌， 李良导

(1.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004； 2.中国农业科学院麻类研究所， 湖南 长沙 410205； 3.湖南女子学院， 湖南 长沙 410004)

一株油茶炭疽病病原拮抗细菌的分离与鉴定

吴天乐1， 陈 艺1， 马 力1， 曾粮斌2， 李良导3

(1.湖南省林业科学院， 湖南 长沙 410004； 2.中国农业科学院麻类研究所， 湖南 长沙 410205； 3.湖南女子学院， 湖南 长沙 410004)

采用梯度稀释涂板法和平板对峙培养法从油茶林根际土中分离、筛选到了一株对油茶炭疽病原具有拮抗作用的细菌，编号为YCSF-1，其对油茶炭疽病病原的抑菌圈直径达20.6 mm。经过形态学、生理生化测定、16Sr RNA序列比对鉴定，该菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)。该研究为油茶炭疽的生物防治提供菌株。

油茶； 炭疽病； 拮抗细菌； 鉴定

油茶(CamelliaoleiferaAbel)是我国特有的木本油料植物，其与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料植物。油茶籽油中以油酸为主的不饱和脂肪酸含量高达90%以上，单价不饱和脂肪酸与高价不饱和脂肪酸的比例接近国际公认的最佳食用油脂肪酸结构比例(10∶1)。同时，油茶籽油还富含维生素E、角鲨烯和山茶皂苷等功能活性成分，长期食用具有增强人体免疫力、延缓衰老、降低血压血脂、预防心脑血管疾病等医疗保健作用，联合国粮农组织已将其作为重点推广的健康型高级食用植物油[1-3]。近年来，油茶产业受到我国各级政府的高度重视，得到大力推广，油茶种植面积迅速增加。

油茶炭疽病是由油茶炭疽菌(Colletotrichumgloeosporioides)引起，是油茶主要的病害之一，发生普遍，能引起严重的落叶、落蕾、落果、枝枯，甚至整株衰亡，可使油茶减产40%～50%，影响油茶品质，造成重大的经济损失，制约油茶产业的发展[4-7]。目前，种植抗性品种和化学防治是油茶炭疽病防治的主要途径。但油茶炭疸病侵染源广，发生期长(终年都有发生)，受害部位多，抗炭疽病的油茶品种少，抗性品种的育种周期较长，难以立即满足油茶种植发展的需求。化学农药防治油茶炭疽病，虽然能在一定程度上快速降低损失，但容易引起油茶炭疽病原抗药性的产生。大剂量化学农药的使用不仅严重污染生态环境，同时使得茶油内的农药残留量增加，降低茶油的品质，影响油茶产业的健康发展。

近年来，国内学者们开始考虑研究从植物或微生物中开发对油茶炭疽病有防治作用的绿色环保的生物农药[3，8-9]。信珊珊等[10-11]从水稻根部分离到的1株对油茶炭疽病有拮抗作用的解淀粉芽孢杆菌WH1，并鉴定、提取了该拮抗菌中抑菌活性物质脂肽。周国英团队从油茶林不同类型土样中分离了194株放线菌，筛选出一株对油茶炭疽病有良好拮抗作用的放线菌F10[12-14]；分离到223株细菌，通过平板对峙培养初步选出抑菌效果较好的菌株21株，其抑菌圈宽度在5.0～12.5 mm，其中菌株Z17和Z26对油茶病害有较好的抑菌效果，具有一定的生防潜力[15]；从健康油茶组织中分离到细菌菌株156株，筛选出一株对油茶炭疽病有明显拮抗作用的内生细菌Y13，与油茶炭疽病原平板对峙时抑菌直径达10 mm，鉴定为枯草芽孢杆菌；开发的Y13菌剂在林间应用，对油茶炭疽病的防效70%以上，与对照药剂百菌清的防治效果相当[16-17]；筛选获得对油茶炭疽病菌具有较强拮抗作用的真菌3株，编号为C5、S2、H18，PAD平板上对油茶炭疽病菌的抑制率分别为60.7%、60.0%、58.0%[18]；筛选出博落回的3种粗提取物对油茶炭疽病菌、油茶软腐病菌均有抑制作用，在一定浓度时，对两种病菌的室内离体抑制率分别达80.87%、61.1%[19]。

综上所述，筛选和利用拮抗微生物成为油茶炭疽病的新型防治技术。本研究以油茶炭疽病原为研究对象，筛选对油茶炭疽病原具有较好的拮抗作用的细菌，为油茶炭疽防控提供新的解决途径。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1 供试菌株 油茶炭疽病病原由中南林业科技大学经济林培育与保护教育部重点实验室菌种保存中心提供。

1.1.2 培养基 NA培养基用于细菌的分离、培养以及发酵种子液的制备；PDA 培养基用于拮抗菌的筛选。

1.1.3 细菌鉴定的主要试剂和仪器 细菌DNA提取试剂盒、DNA maker、dNTP、DNA聚合酶等购自宝生物工程(大连)有限公司；其余均为国产分析纯。电泳仪购自北京六一仪器厂，PCR仪购自美国ABI公司，恒温摇床购自天津欧诺仪器仪表有限公司。

1.2方法

1.2.1 拮抗细菌的分离及筛选 拮抗细菌的分离：采集湖南省林业科学院油茶林的根际土，尽量保持低温下带回实验室4 ℃备用。采用梯度稀释涂板法分离拮抗细菌[20]，取土样5 g置于45 mL的无菌水中，涡旋震荡成均匀悬浮液，将悬浮液分别稀释成10-5、10-6、10-7系列浓度梯度，然后每个浓度梯度分别吸取100 μL均匀涂布至NA 平板上，置于28 ℃下培养，每个浓度重复3次，36 h后挑选形态各异的菌落进行划线纯化，编号并保存于4 ℃备用。

拮抗细菌的筛选：采用平板对峙培养法[21]筛选拮抗细菌，PDA培养基活化培养油茶炭疽病菌至满皿，采用打孔法，将直径为5 mm的油茶炭疽病菌块接种于Ø=9 cm的PDA平板中心，然后将候选细菌点接至距平板中心2.5 cm处，以不接种细菌的平板为对照，每个处理重复3次，平板置于28 ℃下培养，待对照组菌落长满全皿时，测量每个细菌的抑菌圈直径，选出抑菌圈最大即生防潜力最强的目的拮抗细菌，进行后续研究。

1.2.2 形态学观察 将目的拮抗细菌划线接种至NA平板上，30 ℃培养24 h，观察菌落生长形态并进行常规的革兰氏及芽孢染色。

1.2.3 拮抗细菌的生理生化鉴定 参照《伯杰细菌鉴定手册》(第九版)对菌株进行生理生化鉴定。

1.2.4 拮抗细菌的16Sr RNA基因序列分析 采用细菌DNA提取试剂盒提取目的拮抗细菌的DNA；利用通用引物B27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和U1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)扩增细菌16S rRNA片段；PCR反应体系(50 μL)为10× PCR buffer 5 μL，DNA模板 1 μL，dNTP(2.5 mmol/L)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，引物(1 mmol/L)各1 μL，Taq DNA聚合酶 0.5 μL，ddH2O 34.5 μL；反应条件为94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30个循环，4 ℃保存。扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序，将测定的序列在GenBank中进行BLAST相似性比对(available at：http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi )，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining构建系统发育树，确定该菌株的系统发育学地位。

2 结果与分析

2.1拮抗菌的分离和筛选

从湖南省林业科学院油茶林根际土壤中共分离筛选到21株对油茶炭疽菌有拮抗效果的细菌。其中，编号为YCSF-1的菌株对病菌的拮抗能力最强，抑菌圈最大，直径达到20.6 mm(见图 1)。因此，菌株YCSF-1被选用于进一步的研究工作。

图1 YCSF-1对油茶炭疽菌抑制作用Fig.1 YCSF-1 antagonistic effect on Colletotrichum gloeosporioides of Camellia oleifera

2.2YCSF-1菌株的菌种鉴定

2.2.1 形态学特征 菌株YCSF-1在NA平板上，30 ℃培养24 h，菌落呈圆形，污白色，不透明，表面光滑(见图2)；革兰氏染色呈阳性(见图3)，为革兰氏阳性菌；芽孢染色有芽孢生成(见图4)。

图2 YCSF-1菌落形态图Fig.2 A colony of strain YCSF-1

图3 YCSF-1革兰氏染色图Fig.3 Gram-staining of strain YCSF-1

图4 YCSF-1芽孢染色图Fig.4 Spore staining of strain YCSF-1

2.2.2 生理生化特征 由表1可知，YCSF-1菌株能利用半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、D-果糖、D-木糖；葡萄糖发酵、接触酶测定、氧化酶测定、明胶液化测定、硝酸盐还原测定、卵磷脂酶测定呈阳性；能利用丙二酸盐、柠檬酸盐；VP实验呈阳性，甲基红MR测定呈阴性，能分解纤维素，不水解淀粉。初步鉴定为芽孢属。

2.2.3 16S rRNA分子鉴定 以菌株YCSF-1基因组DNA为模板，利用16S rRNA细菌通用引物进行PCR扩增和测序，获得的16S rRNA基因的片段长度为1 452 bp，从GenBank中调取芽孢属不同种的 12株标准菌株的 16S rRNA基因序列，构建系统发育进化树，结果显示(见图5)菌株YCSF-1与侧孢短芽孢(Brevibacillus_laterosporu_(T)_IAM_12465_D16271)的同源关系最近，序列相似性达到99%。综合形态学和生理生化鉴定结果，确定菌株YCSF-1为Brevibacilluslaterosporu(或Bacil-lus laterosporuss)中文名称侧孢短芽孢杆菌。

表1 YCSF-1生理生化特征Tab.1 PhysiologicalandbiochemicalcharacteristicsofYCSF-1表性特征反应特征表性特征反应特征接触酶测定+柠檬酸盐利用+氧化酶测定+卵磷脂酶活性测定+淀粉水解测定-丙二酸盐利用+甲基红MR测定-纤维素分解+VP实验+半乳糖利用+明胶液化测定+阿拉伯糖利用+硝酸盐还原测定+甘露糖利用+葡萄糖发酵+D-果糖利用+产硫化氢测定-D-木糖利用+ 注:“+”代表反应为阳性,“-”代表反应为阴性。

图5 YCSF-1 16Sr RNA比对结果Fig.5 YCSF-1 16Sr RNA sequence alignment result

3 结论与讨论

微生物介导的生物防治由于其对环境的友好性而成为备受人们青睐的可持续发展的一种防控病害的方法。土壤是微生物的天然培养基，生存着许多具有复杂相互作用的微生物，它们共同构成了无比丰富的菌种资源库，根际的微环境中存在大量活性很高、能够影响病原菌的生存或侵染的微生物种群，是人们获得有益微生物的一个重要来源[22]。

侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporu)自被发现以来便受到国内外研究者的兴趣，它具有杀虫、抗菌、抗肿瘤、生物降解转化等多种生物学活性，在生物防治、环境保护、医学、微生物菌剂开发等诸多方面显示了巨大的应用价值和潜力。对多种植物病原真菌如立枯丝核菌、尖孢镰刀菌、杨树烂皮病菌、苹果炭疽病菌、苹果轮纹病菌等有广谱抗性。该菌可以从土壤中获得。赵秀香等[23]从烟草根际土壤中，分离到一株生防菌侧孢短芽孢杆菌B8，其发酵液对烟草黑胫病菌(Phytophthoraparasiticavar.nicotianae)显示了较强的抑制作用。SONG Z.等[24]从苹果根际中分离到侧孢短芽孢杆菌ZQ2，能产生广谱抗性的抑真菌活性物质。陈潺等[25]从山东泰安各种类型土壤中分离得到编号为AMCC 100017侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporus)，平板对峙试验结果表明该菌株对多种植物病原真菌均有较强的拮抗作用。

本文采用梯度稀释涂板法和平板对峙培养法从油茶林根际土壤中共分离筛选到21株对油茶炭疽菌有拮抗效果的细菌。其中，编号为YCSF-1的菌株对病菌的拮抗能力最强，对油茶炭疽病原的抑菌圈直径达到20.6 mm，抑菌圈直径大于以前研究者所筛选的拮抗菌，经过形态学、生理生化测定、16S rRNA序列比对鉴定，该菌株为侧孢短芽孢杆菌(Brevibacilluslaterosporu)。YCSF-1菌株对油茶炭疽病具有一定的生防潜力，可作为防治油茶炭疽病的优良微生物资源，用于开发环境相容性好的微生物生防菌剂。本文只是前期研究，关于YCSF-1对油茶炭菌病的大田防控实验、防治机理、有效抑菌物质的分析、抑菌剂的制备等相关研究还有待开展。

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IsolationandidentificationofanantagonisticbacteriatoColletotrichumgloeosporioidesofCamelliaoleifera

WU Tianle1， CHEN Yi1， MA Li1， ZENG Liangbin2， LI Liangdao3

(1.Hunan Academy of Forestry， Changsha 410004， China；2.Institute of Bast Fiber Crops， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Changsha 410205， China；3.Hunan Women′s University， Changsha 410004， China)

A strain of bacteria was isolated from the rhizosphere soil ofCamelliaoleiferausing plate dilution method and plate confrontation culture method，which had antagonistic effect on ColletotrichumgloeosporioidesofCamelliaoleifera.The diameter of the inhibition zone was 20.6mm.After morphological and 16Sr RNA sequence alignment，this strain was identified asBrevibacilluslaterosporus.The research provided the strains for the biological control ofColletotrichumgloeosporioidesofCamelliaoleifera.

Camelliaoleifera；Colletotrichumgloeosporioides； antagonistic bacteria；identification

2016-07-27

国家林木种质资源平台建设(2016DKA210003)。

S 763.7

A

1003-5710(2016)05-0062-05

10. 3969/j. issn. 1003-5710. 2016. 05. 012

(文字编校：张 珉)