酸性硫酸钙杀菌效果及其安全性研究

张晓丽， 樊树理， 张利平， 钱毅春， 尹幸念， 白国辉， 赵书婷， 王海玲

(1.包头医学院公共卫生学院，内蒙古包头 014060；2.内蒙古疾病预防控制中心卫生毒理所)



酸性硫酸钙杀菌效果及其安全性研究

张晓丽1， 樊树理2， 张利平2， 钱毅春2， 尹幸念2， 白国辉1， 赵书婷1， 王海玲2

(1.包头医学院公共卫生学院，内蒙古包头 014060；2.内蒙古疾病预防控制中心卫生毒理所)

目的：研究酸性硫酸钙对细菌繁殖体的杀灭效果，并通过毒理学试验对其安全性进行初探。方法：杀灭试验采用悬液定量杀菌试验方法，毒理学试验采用急性经口毒性试验和骨髓细胞微核试验。结果：酸性硫酸钙700倍稀释液pH值为1.12，对金黄色葡萄球菌分别作用10 min、20 min和30 min，其杀灭对数值分别为4.03、5.19和6.15，对大肠杆菌分别作用10 min、20 min和30 min，其杀灭对数值分别是5.06、6.10和7.11。急性经口毒性试验分级属实际无毒，小鼠骨髓细胞微核试验阴性。结论：酸性硫酸钙700倍稀释液杀灭细菌繁殖体金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的效果良好，毒理学试验结果提示安全性可靠。

酸性硫酸钙；细菌繁殖体；杀灭效果；毒理

酸性硫酸钙(acidic calcium sulfate，ACS)是将硫酸、硫酸钙、氢氧化钙等3种物质按比例混合，令其在特定的工艺条件下反应，最后运用膜技术方法移除反应所生成的固体物质制备而成的无色、无味、透明的酸性液体[1]，其化学本质是一种微溶性ⅡA族络合物的酸性溶液[2]，酸当量浓度与98 %硫酸相当，相关研究表明ACS的核心杀菌效果是强酸[3]。酸性硫酸钙可任意用水稀释，并随着稀释过程中pH值的不断变化而表现出不同的杀菌功效。为了解酸性硫酸钙的杀灭效果及其毒理学安全性，我们进行了相关的实验室研究。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 ACS稀释液(由内蒙某公司提供，稀释度为1∶700)，为无色透明液体，无特殊气味。

1.1.2 试验菌种 金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(8099)由军事医学科学院消毒检测中心提供。

1.1.3 实验动物及饲料 KM小鼠由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK(京)2012-0001，饲料由北京科奥协力饲料有限公司提供，饲料生产许可证号：SCXK(京)2009-0012，小鼠饲养于屏障动物实验室内，实验动物使用许可证号：SYXK(蒙)2010-0001。实验室温度为20～22 ℃，湿度为40 %～70 %。

1.2 试验方法[4]

1.2.1 pH值测定 用PHS-3C型酸度计，测定ACS700倍稀释液的pH值。

1.2.2 悬液定量杀菌试验

1.2.2.1 细菌繁殖体菌悬液的制备 取试验菌株第6代营养琼脂培养基斜面新鲜培养物(37 ℃培养24 h)，用无菌吸管吸取5.0 mL稀释液(胰蛋白胨生理盐水溶液)加入斜面试管内，反复吹吸，洗下菌苔，随后用吸管将洗液全部转移至另一无菌试管中，用电动混合器振荡20 s，制成菌悬液(菌数范围在1×108cfu/mL～5×108cfu/mL)，试验时以3 %牛血清白蛋白溶液对半稀释，配制成试验用菌悬液。

1.2.2.2 中和剂鉴定试验 以金黄色葡萄球菌为试验菌，设计6组试验。结果评价标准为：第1组无试验菌生长或仅有极少数生长，明显低于第2组；第2组有菌生长且试验菌菌落数较第1组多，较第3、4、5组少；第3、4、5组有相似量试验菌生长，悬液试验在1×107cfu/mL～5×107cfu/mL之间，其组间菌数误差率不超过15 %；第6组为阴性对照，无菌生长。重复试验3次结果一致，可判定所选中和剂及其浓度适宜。

1.2.2.3 杀菌性能试验 取无菌试管，先加入0.5 mL试验用菌悬液，再加入0.5 mL有机干扰物(3 %牛血清白蛋白溶液)，充分混匀，将其置(20±1) ℃水浴中5 min后，吸取酸性硫酸钙稀释液(1∶700)4.0 mL，注入其中，迅速混匀并立即记时，分别作用10 min、20 min、30 min、吸取0.5 mL混合液移入含4.5 mL中和剂的试管中混匀。中和10 min，用稀释液做10倍系列稀释，吸取该最终样液1 mL接种于平皿，每管接种2个平皿，置37 ℃培养48 h，活菌计数。

1.2.3 毒理学试验

1.2.3.1 急性经口毒性试验 采用一次最大限度试验，选用KM小鼠20只，雌、雄各半。体重为18～22 g。受试样品所设计量为5 000 mg/(kg·bw)。将受试物取6.3 mL用蒸馏水定容到25 mL容量瓶中，配制成相应浓度溶液。经口灌胃给与受试物。灌胃量为0.2 mL/(kg·bw)，一次给予受试物。灌胃前动物禁食16 h左右，自由饮水。灌胃后给予正常饮食，连续观察并记录2周内小鼠的中毒表现及死亡情况。

1.2.3.2 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 KM小鼠50只，体重25～30 g，随机分为5组，每组10只，雌、雄各半。将受试物设3个剂量组，分别为5 000、2 000、500 mg/(kg·bw)，同时设阴性对照组(蒸馏水)和阳性对照组环磷酰胺(CP)40 mg/(kg·bw)。取受试物7.55、3.02、0.76 mL，均加蒸馏水至30 mL配制成悬液；灌胃量为0.2 mL/(kg·bw)，经口2次灌胃给予受试物，中间间隔24 h，并于第2次灌胃6 h后颈椎脱臼处死小鼠，取胸骨骨髓用小牛血清涂片、甲醇固定、Giemsa染色、镜检。每只鼠计数1 000个嗜多染红细胞的微核细胞数。微核发生率以含微核的千分率记，同时计数200个嗜多染红细胞与成熟红细胞的比值，运用SPSS 13.0进行卡方检验统计处理。

2 结果

2.1 运用酸度计测得ACS 700倍稀释液的pH值为1.12。

2.2 中和剂鉴定结果 3次重复试验结果表明，用含3 %卵磷脂，5 %吐温-80的磷酸盐缓冲液作为中和剂，可以有效中和ACS 700倍稀释液对试验微生物的残留作用，且中和剂溶液和中和产物溶液对试验菌生长和培养基均无影响，见表1。

表1 杀菌性能试验中和剂鉴定结果

注：第6组无菌生长

2.3 杀菌性能试验结果 ACS 700倍稀释液作用10 min、20 min、30 min，对悬液内金黄色葡萄球菌的杀灭对数值分别为4.03、5.19和6.15，对悬液内大肠杆菌群的杀灭对数值分别是5.06、6.10和7.11。见表2。

表2 ACS对细菌繁殖体的杀灭效果

注：阴性对照组均为阴性。

2.4 急性经口毒性试验结果 经口给予ACS 700倍稀释液后的小鼠观察期内一般表现和行为均未见异常，无明显中毒症状，未见动物死亡，试验结束时，处死动物大体肉眼未见异常，根据《消毒技术规范》2002年版，ACS 700倍稀释液一次最大限度试验LD50>5 000 mg/(kg·bw)。根据急性毒性剂量分级表，判定ACS 700倍稀释液实际无毒。见表3。

表3 急性经口毒性观察情况

2.5 小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验 运用SPSS 13.0进行卡方检验，雌鼠的高、中、低3个剂量组的微核千分率与阴性对照组比较差异无统计学意义(X2=8.146，P>0.01)，阳性对照组与阴性对照组比较差异有统计学意义(χ2=147.777，P<0.01)。雄鼠的高、中、低3个剂量组的微核千分率与阴性对照组比较差异无统计学意义(χ2=0.334，P>0.01)，阳性对照组与阴性对照组比较差异有统计学意义(χ2=150.414，P<0.01),结果未见ACS 700倍稀释液诱发小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率增高，见表4。嗜多染红细胞/成熟红细胞的比值在正常范围内。

3 讨论

ACS是目前国际上最新型的一种杀菌防腐产品。国外的ACS已成功应用于肉制品、蔬果、畜牧、水产等产业[5]。2010年8月，我国商务部以食品添加剂的方式从美国引进ACS，意在畜牧、兽医、和水产领域作推广和应用，因此国内对ACS消毒防腐的研究报道较少，相关参考文献结果表明ACS可以作为消毒剂使用。

表4 小鼠骨髓细胞微核试验结果

a为与阴性对照组比较P<0.01 本次试验研究结果表明，ACS 700倍稀释液在作用时间10 min～30 min内对细菌繁殖体金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的杀灭效果随时间的增加而增强，其中ACS 700倍稀释液作用10 min对大肠杆菌的杀灭对数值大于5，而对金黄色葡萄球菌要达到同样的消毒效果，则需要作用20 min，说明金黄色葡萄球菌的抗力较大肠杆菌强。急性经口毒性试验表明ACS 700倍稀释液对雌雄小鼠经口LD50均>5 000 mg/(kg·bw)，属实际无毒物质；小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验显示其小鼠骨髓嗜多染红细胞微核率和嗜多染红细胞/成熟红细胞的比值均在正常范围内，提示其该剂量下未见染色体损伤作用。因为本次试验仅选用了遗传毒性试验中的一种，因此要确定ACS 700倍稀释液是否有遗传毒性应进行下一步试验来研究，具有进一步研究的价值。

[1] 艾景军.酸性硫酸钙替代抗生素对生长育肥猪生产性能和肉品质的影响[J].饲料与畜牧规模养猪,2011,10(6):16-18.

[2] 艾景军.酸性硫酸钙使用中需要注意的问题[J].中国动物保健,2012,14(2):21-22.

[3] 吉钟山,谈智,孙巍,等.酸性硫酸钙杀菌因子初探[J].中国消毒学杂志,2013,30(5):409-410.

[4] 卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范[S].北京:中华人民共和国卫生部,2002:15-126.

[5] J.Davies Anuta,Alejandro Buentello,Susmita Patnaik,et al.Effect of Dietary Supplementation of Acidic Calcium Sulfate (Vitoxal) on Growth, Survival,Immune Response and Gut Microbiota of the Pacific White Shrimp, Litopenaeus vannamei[J].Journal of the World Aquaculture Society,2011,42(6):834-844.

Bactericidal effects and security study of acid calcium sulfate

ZHANG Xiaoli1, FAN Shuli2, ZHANG Liping2,QIAN Yichun2,YIN Xingnian2,BAI Guohui1,ZHAO Shuting1, WANG Hailing2

(1.PublicHealthSchoolofBaotouMedicalCollege,Baotou014040,China;2.ToxicologyInstituteofInnerMongoliaAutonomousRegionCenterforDiseasesControlandPrevention, 010031Huhehaote,China)

Objective:To study the germicidal efficacy of acid calcium sulfate and make a preliminary study of its security by toxicology test. Methods:Suspension quantitative germicidal test method was adopted to realize kill effect and acute oral toxicity test and bone marrow cells micronucleus test were used in the toxicology test. Results:Acid calcium sulfate pH value is 1.12 when 700 times diluted. Its killing log values were 4.03, 5.59 and 6.15 respectively when it worked on Staphylococcus auerus in 10 min, 20 min and 30 min. And its killing log values were 5.06, 6.10 and 7.11 when it worked on Escherichia coli in 10 min, 20 min and 30 min. Acute oral toxicity test was classified as non-toxic and mouse bone marrow cells micronucleus test was negative. Conclusion:700 times acid calcium sulfate diluent works well in killing Staphylococcus aureus and Escherichia coli, and toxicology tests results suggest that 700 times dilution of acid calcium sulfate is safe and reliable.

Acid calcium sulfate; Bacteria; Germicidal effect; Toxicology

2015-09-04)