HPLC法同时测定参芪扶正注射液中6种成分的含量

舒 娟，杨胜斌（1.铜仁市食品药品检验所，贵州铜仁 554300；.铜仁市人民医院，贵州铜仁 554300）

HPLC法同时测定参芪扶正注射液中6种成分的含量

舒 娟1＊，杨胜斌2（1.铜仁市食品药品检验所，贵州铜仁 554300；2.铜仁市人民医院，贵州铜仁 554300）

目的：建立同时测定参芪扶正注射液中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素含量的方法。方法：采用高效液相色谱法。色谱柱为Ultimate XB-C18，检测器为蒸发光散射检测器，流动相为乙腈-0.5%甲酸（梯度洗脱），流速为1.2 ml/min，柱温为30℃，进样量为10 μl。结果：黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、党参炔苷和芒柄花素检测进样量线性范围分别为0.62～5.67 μg（r=0.999 6）、0.78～6.31 μg（r=0.999 6）、0.36～3.48 μg（r=0.999 7）、0.81～6.72 μg（r=0.999 5）、0.82～7.03 μg（r=0.999 8）、0.58～6.62 μg（r= 0.999 7）；定量限分别为1.21、0.15、0.12、0.03、0.12、0.17 μg/ml；检测限分别为0.35、0.35、0.04、0.01、0.03、0.04 μg/ml；精密度、稳定性、重复性试验的RSD＜2%；加样回收率分别为95.1%～101.1%（RSD=2.0%，n=9）、95.2%～100.7%（RSD=1.9%，n=9）、95.8%～100.2%（RSD=1.4%，n=9）、96.2%～100.6%（RSD=1.7%，n=9）、96.6%～101.2%（RSD=1.4%，n=9）、95.9%～99.5%（RSD=1.2%，n=9）。结论：该方法操作简便、结果准确，可用于同时测定参芪扶正注射液中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、党参炔苷和芒柄花素的含量。

参芪扶正注射液；高效液相色谱法；黄芪皂苷Ⅰ；黄芪皂苷Ⅱ；黄芪皂苷Ⅲ；黄芪皂苷Ⅳ；党参炔苷；芒柄花素

参芪扶正注射液主要由党参和黄芪两味中药材组成，具有益气扶正的功效，主要用于提高气虚患者的免疫力，改善其气虚症状和生存质量［1-3］。方中黄芪主要成分包括皂苷、氨基酸类、多糖以及黄酮等成分，其中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和芒柄花素是该药材的主要活性成分，具有较好的免疫调节作用，在抗氧化、抗肿瘤和抗疲劳等方面亦具有较好的药理作用［4-5］。党参炔苷则是党参的主要活性成分，其在提高免疫方面均具有较好的疗效［6-7］。目前，尚未有对黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素这6种主要活性成分进行同时测定的报道［7-10］。因此，笔者采用高效液相色谱法（HPLC）、蒸发光散射检测器（ELSD）建立了同时测定参芪扶正注射液中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素含量的方法，以期为该制剂的质量控制提供参考。

1 材料

1.1 仪器

1220型HPLC仪，自动进样器、柱温箱、四元泵、LE-780型ELSD（美国Agilent公司）；EO243S型万分之一电子天平（德国Eppendorf公司）；SQ-4200型超声波清洗器（上海精密仪器仪表有限公司，功率：250 W，频率：50 kHz）。

1.2 药品与试剂

参芪扶正注射液（丽珠医药集团股份有限公司，批号：2014050179、2014060132、2014070121、2014080131、2014090133，规格：250 ml/瓶）；黄芪皂苷Ⅰ对照品（批号：98087110）、黄芪皂苷Ⅱ对照品（批号：98086745）、黄芪皂苷Ⅲ对照品（批号：98082873）和黄芪皂苷Ⅳ对照品（批号：98086721）均购自美国Sigma公司，纯度均≥98%；党参炔苷对照品（批号：111712-201401）、芒柄花素（批号：111712-201412）均购自中国食品药品检定研究院，纯度均＞98%；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

色谱柱：Ultimate XB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；检测器：ELSD；流动相：乙腈-0.5%甲酸，梯度洗脱（洗脱程序见表1）；流速：1.2 ml/min；柱温：30℃；进样量：10 μl。

表1 梯度洗脱程序Tab 1 Gradient elution program

2.2 溶液的制备

2.2.1 混合对照品溶液 分别精密称取黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素对照品适量，精密称定，置于同一25 ml量瓶中，加甲醇制成1 ml含黄芪皂苷Ⅰ1.12 mg、黄芪皂苷Ⅱ1.24 mg、黄芪皂苷Ⅲ0.78 mg、黄芪皂苷Ⅳ1.82 mg、党参炔苷2.18 mg、芒柄花素1.23 mg的混合对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 精密量取样品20 ml，减压蒸馏后得到浸膏并制备冻干粉末，备用。取上述冻干粉末0.1 g，精密称定，置于50 ml量瓶中，加甲醇30 ml，超声处理30 min，放冷至室温，加甲醇定容，摇匀，经0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 阴性对照溶液 按样品的制备工艺和配方比例分别制备缺黄芩和缺党参的阴性样品，再按“2.2.2”项下方法分别制备阴性对照溶液（A和B），即得。

2.3 系统适用性试验

精密量取“2.2”项下混合对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液（A和B）各适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录色谱，详见图1。由图1可知，在该色谱条件下，各成分均能达到基线分离，分离度＞1.5；理论板数以黄芪皂苷Ⅱ峰计为2 000，保留时间为25.5 min。结果表明，其他成分对测定无干扰。

图1 高效液相色谱图A.混合对照品；B.供试品；C.阴性对照A；D.阴性对照B；1.党参炔苷；2.黄芪皂苷Ⅳ；3.黄芪皂苷Ⅲ；4.芒柄花素；5.黄芪皂苷Ⅱ；6.黄芪皂苷ⅠFig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control A；D. negative control B；1.lobetyolin；2.astragalosideⅣ；3.astragalosideⅢ；4. formononetin；5.astragalosideⅡ；6.astragalosideⅠ

2.4 线性关系考察

精密量取“2.2.1”项下混合对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml，分别置于5 ml量瓶中，加甲醇定容，超声处理5 min，即得系列线性溶液；取上述溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。以待测成分进样量（x，μg）为横坐标、峰面积（y）为纵坐标进行线性回归，回归方程与线性范围见表2。

表2 回归方程与线性范围Tab 2 Regression equations and linear ranges

2.5 定量限与检测限考察

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，等倍逐步稀释，按“2.1”项下色谱条件连续进样测定6次，记录峰面积。当信噪比为10∶1时，得定量限（LOQ）；当信噪比为3∶1时，得检测限（LOD），结果见表3。

表3 定量限与检测限测定结果Tab 3 Determination results of quantitation limit and detection limit

2.6 精密度试验

取“2.2.1”项下混合对照品溶液适量，按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素峰面积的RSD分别为1.2%、1.0%、1.3%、0.7%、0.8%、1.2%（n=6），表明仪器精密度良好。

2.7 稳定性试验

取“2.2.2”项下供试品溶液适量，分别于室温下放置0、1、2、4、8、24 h时按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积。结果，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素峰面积的RSD分别为1.3%、1.2%、1.3%、0.9%、1.1%、1.6%（n=6），表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.8 重复性试验

取样品（批号：2014050179）适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算各成分含量。结果，黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素的平均含量分别为0.082 0、0.007 9、0.017 1、0.049 0、0.003 9、0.052 8 mg/g，RSD分别为1.2%、1.1%、1.9%、1.7%、1.8%、1.8%（n=6），表明本方法重复性良好。

2.9 加样回收率试验

取已知含量的样品（批号：2014050179）适量，按“2.2.2”项下方法制备冻干粉末，称取9份，每份约2 g，精密称定，置于10 ml量瓶中，分别加入低、中、高质量的黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算加样回收率，结果见表4。

2.10 样品含量测定

取“1.2”项下5批样品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，再按“2.1”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和党参炔苷、芒柄花素的含量，结果见表5。

表4 加样回收率试验结果（n=9）Tab 4 Results of recovery tests（n=9）

表5 样品含量测定结果（n=3，mg/g）Tab 5 Results of contents determination of samples（n=3，mg/g）

3 讨论

笔者分别考察了甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-水、乙腈-0.5%甲酸作为本试验的流动相对待测成分分离度的影响。结果，采用甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸、乙腈-水作为流动相时，各成分的分离度不好、均有拖尾现象，而采用乙腈-0.5%甲酸作为流动相时各成分分离效果均较好，因此选择乙腈-0.5%甲酸为本试验的流动相。

综上所述，本方法操作简便、结果准确，可用于同时测定参芪扶正注射液中黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、党参炔苷和芒柄花素的含量。

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（编辑：刘 柳）

Simultaneous Determination of Six Components in Shenqi Fuzheng Injection by HPLC

SHU Juan1，YANG Shengbin2（1.Tongren Institute for Food and Drug Control，Guizhou Tongren 554300；2.Tongren People’s Hospital，Guizhou Tongren 554300，China）

OBJECTIVE：To establish a method for the contents determination of astragalosidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，lobetyolin and formononetin in Shenqi fuzheng injection.METHODS：HPLC was performed.The detector was evaporative light scattering detector，column was Ultimate XB-C18with mobile phase of acetonitrile-0.5%formic acid（gradient elution）at a flow rate of 1.2 ml/min，column temperature was 30℃，and injection volume was 10 μl.RESULTS：The linear range was 0.62-5.67 μg for astragalosidesⅠ（r=0.999 6），0.78-6.31 μg for astragalosidesⅡ（r=0.999 6），0.36-3.48 μg for astragalosidesⅢ（r=0.999 7），0.81-6.72 μg for astragalosidesⅣ（r=0.999 5），0.82-7.03 μg for lobetyolin（r=0.999 8）and 0.58-6.62 μg（r=0.999 7）formononetin；limit of quantitation was 1.21，0.15，0.12，0.03，0.12，0.17 μg/ml；limit of detection was 0.35，0.35，0.04，0.01，0.03，0.04 μg/ml；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 2%；recoveries were 95.1%-101.1%（RSD=2.0%，n=9），95.2%-100.7%（RSD=1.9%，n=9），95.8%-100.2%（RSD=1.4%，n=9），96.2%-100.6%（RSD=1.7%，n=9），96.6%-101.2%（RSD=1.4%，n=9）and 95.9%-99.5%（RSD=1.2%，n=9），respectively.CONCLUSIONS：The method is simple and accurate，and can be used for the simultaneous determination of astragalosidesⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ，lobetyolin and formononetin in Shenqi fuzheng injection.

Shenqi fuzheng injection；HPLC；AstragalosideⅠ；AstragalosideⅡ；AstragalosideⅢ；AstragalosideⅣ；Lobetyolin；Formononetin

R917

A

1001-0408（2016）30-4275-03

2016-05-18

2016-08-07）

＊主管中药师。研究方向：中药及中成药的检验方法及质量控制。E-mail：563965969@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2016.30.32