肥城桃果实VDAC基因的克隆、生物信息学分析及蛋白诱导表达

衣冠帅　刘雨辰　朱树华

摘要：线粒体膜通透性转换孔（MPTP）是线粒体膜上的一种蛋白复合体，在线粒体介导的程序性死亡过程中起着重要作用。电压依赖型阴离子通道蛋白（VDAC）是MPTP的重要组成蛋白，可调节其开放与关闭，但VDAC在植物体中的作用机理尚不明确。本试验通过RT-PCR结合DNA末端快速扩增（RACE）方法，克隆得到肥城桃果实线粒体VDAC基因cDNA，全长共1225bp，其中编码区828bp，编码276个氨基酸；氨基酸序列比对和系统进化树分析发现，桃果实VDAC与其它植物的VDAC蛋白具有较高的一致性；体外构建了pET-30a-VDAC重组表达载体，并成功在大肠杆菌BL21（DE3）中进行表达；使用镍柱纯化法，得到纯化的重组蛋白，为下一步研究桃果实VDAc蛋白的结构和功能奠定了基础。

关键词：肥城桃；线粒体；电压依赖型阴离子通道蛋白（VDAC）；基因克隆；生物信息学分析；蛋白表达

中图分类号：S662.1+Q78 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0001-07

线粒体存在于大多数真核细胞中，是细胞的微型“能量工厂”，在细胞疾病、衰老、信号转导、增殖和调节细胞凋亡等方面发挥重要作用。线粒体通透性转换（MPT）对细胞影响巨大，当其发生时，分子量在15kD以下的蛋白、一些离子和其它有害代谢物可以自由进出原本不允许通过的线粒体内膜，导致其跨膜电势消失、ATP合成受阻、线粒体渗透压降低，最终使线粒体发生肿胀，甚至破裂。目前普遍的研究表明，线粒体膜通透性转换受一种跨线粒体内外膜的蛋白复合体调节，称之为线粒体膜通透性转换孔（MPTP）。

线粒体电压依赖型阴离子通道蛋白（VDAC）是线粒体外膜上的一种高度保守的蛋白质，几乎存在于所有物种的线粒体表面，是线粒体外膜上最丰富的蛋白，对于保持线粒体与细胞质之间的物质和能量代谢起着十分重要的作用。因此，VDAC被认为很有可能是MPTP的重要组成部分。研究发现，VDAC的超表达会导致细胞凋亡速率增加，这可能是由于VDAC蛋白含量的增高会导致其在线粒体膜表面形成多聚体，这种多聚体首先在植物体中被发现。通过对酵母菌、小鼠、人类等多种细胞的VDAC超表达研究发现，这些细胞发生凋亡的概率都有所升高。另有研究表明，伴随VDAC超表达而产生的活性氧（ROS）的增加也是导致细胞凋亡的重要原因。

目前，关于VDAC蛋白在动物及人体中作用的研究已经开展了很多，但在植物体中的研究还不是很成熟。本试验以肥城桃果实为材料，克隆得到桃果实线粒体VDAC基因全长，并在大肠杆菌中成功表达获得重组蛋白，以期进一步了解植物VDAC蛋白的结构和功能。

1 材料与方法

1.1 试验材料

肥城桃[Prunus persica（L.）Batsch cv.Feicheng]果实采自山东省肥城市桃园镇。从长势良好、无病虫害的植株上随机选取大小相近、色泽均匀、无机械损伤的桃果实，采摘后当天运回实验室，4℃预冷24h。果肉切块后用液氮冷冻处理，-80℃冰箱保存备用。

大肠杆菌E.coli BL21（DE3）、DH50t，表达载体pET-30a质粒均为本实验室保存。克隆载体pMD18-T Vector购自TaKaRa公司。

试验所需引物（表1）由北京六合华大基因科技公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 肥城桃果实总RNA的提取及第一链cDNA的合成参照改良CTAB法提取肥城桃果实总RNA。使用TaKaRa公司的PrimeScript Ⅱ 1st StrandcDNA Synthesis Kit试剂盒合成第一链cDNA。

1.2.2 肥城桃果实线粒体VDAC基因中间序列的克隆从GenBank中查找其它植物的VDAC基因序列，使用Primer Premier 5.0设计简并引物VDAC-F、VDAC-R，以反转录的cDNA为模板进行PCR扩增，产物经1%琼脂糖凝胶电泳后将目的片段切胶，使用Mini BEST Agarose Gel DNAExtraction Kit Ver.4.0（TaKaRa）试剂盒进行DNA片段的回收。之后连接pMD18-T Vector，进行克隆载体的构建，转化大肠杆菌DH5α。筛选阳性克隆，经菌液PCR检测后，送华大基因公司进行测序。

1.2.3 肥城桃果实VDAC基因全长的获得及生物信息学分析根据中间片段的测序结果，设计RACE引物GSP1、GSP2及巢氏引物NGSP1、NG-SP2。使用SMARTerTM RACE cDNA（TaKaRa）试剂盒进行5'-RACE与3'-RACE。巢式PCR产物电泳切胶回收后，按上述方法构建克隆载体、测序，将测序得到的5端序列和3端序列与中间片段拼接，得到VDAC基因全长序列。将全长序列在NCBI ORF Finder分析开放阅读框，并在NC-BI数据库中查找同源序列，使用DNAMAN软件进行氨基酸序列的比对分析，通过MEGA 4.1软件分析桃果实VDAC与其它植物VDAC蛋白序列的进化关系，构建系统进化树。利用ProtParamtool（http：//web.expasy.org/protparam/）在线分析蛋白的理化性质。利用ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白的亲水性。使用TMHMM（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TM—HMM/）预测蛋白跨膜结构。最后使用在线网站提供的工具对VDAC蛋白进行二维及三维结构的模拟。

1.2.4 VDAC蛋白的体外表达

根据VDAC的开放阅读框，设计带有酶切位点的引物VDAC-1、VDAC-2。经PCR获取VDAC全长片段，使用pMD18-T Vector按上述方法构建克隆载体。克隆载体与pET-30a质粒经双酶切后将目的条带切胶回收，使用TaKaRa T4 DNA Ligase进行连接，获得重组质粒pET-30a-VDAC。将重组质粒导入表达菌株BL21（DE3），经菌液PCR验证无误后进行蛋白表达。取100μL菌液加入到50mL新鲜的LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养至菌液OD₆₀₀=0.4～0.6，取1mL菌液用于对照，向剩余菌液中加入50μL1mol·L^-1IPTG至终浓度为1mmol·L^-1，37℃诱导过夜，取1mL菌液进行12%SDS-PAGE电泳检测。

1.2.5 重组VDAC蛋白的纯化

使用His标记蛋白质专用镍柱介质（Tiandz）进行蛋白纯化，方法按照使用说明进行。用200mmol·L^-1咪唑洗脱液洗脱蛋白。纯化后的VDAC蛋白进行SDS-PAGE电泳分析。

2 结果与分析

2.1 VDAC基因全长的获得

通过对比不同植物VDAC基因序列，根据其保守区序列设计了简并引物，以反转录得到的第一链cDNA为模板进行PCR，所得结果如图1A所示，在500bp左右出现目的条带，符合预期长度。将该条带回收并克隆测序，根据此序列设计了RACE引物及巢氏引物。如图1B，5-RACE巢氏PCR与3-RACE巢氏PCR均得到与预期长度相符合的目的条带，将5-RACE与3-RACE测序结果与中间片段拼接，得到肥城桃VDAC基因全长序列共1225bp（图2A），在GenBank中的登录号为KJ652911.1。

2.2 VDAC基因的生物信息学分析

经分析，该序列含有起始密码子ATG（80bp）和终止密码子TAG（909bp），具有完整的开放阅读框。阅读框共有828个碱基，编码276个氨基酸，其氨基酸序列如图2B所示。ProtParamtool预测蛋白分子式为C₁₃₂₈H₂₁₀₇N₃₅₉O₄₁₇S，分子量为29806.5D，理论等电点为7.88，不稳定系数为12.67。ProtScale分析其疏水性平均值为-0.205，表明VDAC为亲水性蛋白。TMHMM跨膜结构域预测VDAC为膜外蛋白。从二级结构预测结果（图3A）可以发现，肥城桃VDAC蛋白在起始位置有一段α螺旋结构，紧接着是无规则卷曲与β折叠结构交替出现，总共有19段β折叠结构。肥城桃VDAC三级结构的预测结果为桶状（图3B）。在二级结构预测中的β折叠结构平行排列，围绕成一个管道，而N端的α螺旋结构则单独位于管道的中间。进行对比。结果显示，桃果实VDAC与其它植物VDAC氨基酸序列同源性较高，其中与橙子（Cit-rus sinensis）、白梨（Pyrus bretschneideri）、葡萄（Vi-tis vinifera）、麻风树（Jatropha curcas）、荷花（Ne-lumbo nucifera）、巨桉（Eucalyptus grandis）、马铃薯（Solanum tuberosum）的相似度分别为87.68%、94.57%、74.28%、84.06%、78.62%、72.10%、73.91%，说明植物的VDAC蛋白具有较高的保守性（图4）。系统进化树显示，桃果实VDAC与白梨VDAC聚为一类，说明二者亲缘关系最近（图5）。

2.4 VDAC蛋白的体外表达及纯化

使用T4连接酶将带有酶切位点的VDAC基因片段与表达载体pET-30a连接，重组质粒导人大肠杆菌B121（DE3），加入IPTG诱导表达，获得VDAC重组蛋白。电泳结果（图6A）显示，VDAC重组蛋白成功表达，分子量约31kD。从菌液中分离出包涵体，用含尿素的结合液溶解，经过镍柱纯化的VDAC重组蛋白（图6B）中基本不含其它杂蛋白，纯度较高。

3 结论与讨论

本试验采用同源克隆的方法获得了肥城桃VDAC基因中间片段，之后根据中间片段设计RACE引物，获得VDAC5及3端序列，通过拼接得到准确的肥城桃VDAC基因cDNA全长。对其进行生物信息学分析发现，桃VDAC蛋白与其它植物VDAC蛋白具有较高的同源性。本试验还体外重组了表达载体pET-30a-VDAC，在BL21（DE3）中诱导表达得到VDAC重组蛋白，并利用Ni-NTA与带有His标签的VDAC重组蛋白结合，将目的蛋白从杂蛋白中分离出来。

Hiller等对从包涵体中复性的VDAC蛋白进行的核磁共振和X射线衍射分析发现，VDAC蛋白是由19段β折叠构成的筒状结构蛋白。前人研究显示，VDAC蛋白的N端存在长度为20个氨基酸的α螺旋结构，这段螺旋结构表现出一面疏水一面亲水的性质；在复性的或是失去活性的VDAC蛋白中，这段仅螺旋结构始终位于VDAC蛋白的内腔中，说明它在VDAC蛋白的结构功能中有着重要的意义。对桃果实VDAC蛋白的三级结构模拟结果与已确定的人类VDAC1蛋白和烟草NtVDAC1.1蛋白极为类似。

目前的研究发现，许多代谢产物和蛋白如ATP/ADP、活性氧、谷胱甘肽、己糖激酶等都表现出对线粒体通透性的调节作用，因此可以推断VDAC蛋白参与了这些物质对线粒体通透性的调节。其中，己糖激酶（HK）对体外重组的VDAC蛋白表现出直接的抑制作用。研究发现，HK可以诱导VDAC关闭，而当HK从VDAC蛋白上释放出来时，VDAC得以重新开启。由此认为，HK诱导VDAC蛋白关闭进而抑制了MPTP的开放。另有研究表明，HK与VDAC在植物体内存在共表达现象。更多关于肥城桃果实线粒体VDAC重组蛋白活性检测、结构分析的试验正在进行中，将为MPTP的组成和功能、VDAC调控MPTP开放机理乃至细胞凋亡机制提供理论依据。