黄瓜棒孢叶斑病病菌产毒条件及毒素活性检测

高苇　王勇　张春祥

摘要：为明确黄瓜棒孢叶斑病病原菌多主棒孢的最佳产毒培养基和培养时间，本研究从天津地区采集的黄瓜棒孢叶斑病叶片上分离到强致病菌株HG2，通过种子萌发生长法、叶片萎蔫法、叶片圆盘法及悬滴接种法4种方法测定其粗毒素的生物活性。结果表明，黄瓜多主棒孢菌最适产毒培养基为改良Czapek培养基，培养时间为21～25d，种子萌发生长法和叶片萎蔫法更适合粗毒素活性测定。

关键词：多主棒孢菌；培养条件；粗毒素；毒素活性

中图分类号：S436.421.1⁺9 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2016）04-0094-04

黄瓜棒孢叶斑病是由多主棒孢菌（Corynspo-ra cassiicola）引起的一种真菌性病害，主要侵染植物叶片、茎、花和果实，严重时造成落叶、落果等现象。在我国，1993年，河南、辽宁等报道过黄瓜栽培地普遍受到多主棒孢菌侵染。近年来，山东、河北、北京、辽宁、吉林、河南、海南等绝大多数黄瓜栽培地棒孢叶斑病危害严重，给农民带来巨大的经济损失，成为黄瓜生产中的主要病害。在黄瓜棒孢叶斑病的防治中，抗病品种选育是最经济、有效的措施。因此，选育抗黄瓜棒孢叶斑病综合性状优良的黄瓜品种对其产业发展具有重要意义。

植物病原真菌可以分泌产生毒素，使寄主植物产生特定的病症反应，在植物病害的发生过程中具有明显的致病作用。近年来，人们日益关注植物病原真菌产生的一系列毒素在寄主品种抗病性快速鉴定、抗病性突变体筛选等抗病育种研究方面的应用，探索诱导病原菌产毒条件的研究成为新的热点。目前，关于侵染橡胶树的病原真菌多主棒孢菌毒素的分离提取、活性成分鉴定方面已有部分研究报道，发现多主棒孢菌产生的毒素cassiicolin是一种寄主选择性毒素。同时，研究显示侵染橡胶和黄瓜的多主棒孢菌在菌株的形态学、致病力及系统发育上都存在显著差异，而对于侵染黄瓜的多主棒孢菌毒素的研究报道较少。本研究对黄瓜多主棒孢菌产毒最适条件及毒素活性检测方法进行研究，以期找到该病原菌产毒的最适培养基及培养时间，建立简单、可比较的毒素活性检测方法，为黄瓜抗棒孢叶斑病毒素致病机制及其在抗病品种、抗病突变体筛选等方面的应用研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

黄瓜棒孢叶斑病典型的发病标本于2012年9月采集于天津市西青区张家窝村。按常规组织分离方法分离获得病原菌，经纯化及单孢分离获得12株黄瓜多主棒孢菌纯培养菌株。该菌株可以侵染黄瓜，在黄瓜真叶上形成黄色的圆形或不规则形病斑。依据柯赫氏法则进行致病力鉴定，获得致病力较强的菌株HG2，作为产毒培养基筛选的靶标菌株。

1.2 黄瓜多主棒孢菌粗毒素滤液的制备

本试验采用以下4种液体培养基：（1）改良Fries培养基：蔗糖30g，酒石酸铵5g，NH₄NO₃1g，MgSO₄0.5g，NaCl0.5g，CaCl₂0.1g，酵母膏0.5g，蒸馏水1L，调pH值至7.0。（2）PD培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，加蒸馏水至1L。（3）改良Czapek培养基：蔗糖30g，L-谷氨酸2.2g，KCl1g，K₂HPO₄0.5g，MgSO₄·7H₂O0.5g，FeSO₄·7H₂O0.01g，ZnSO₄·7H₂O0.01g，CuSO₄·7H₂O0.01g，蒸馏水1L，调pH值至7.0。（4）Richard培养基：蔗糖50g，KNO₃10g，K₂HPO₄5g，MgSO₄2.5g，FeCl₃0.02g，蒸馏水1L。

在250mL三角瓶中分别加入150mL上述液体培养基，每种液体培养基24瓶。将供试黄瓜多主棒孢菌菌株移至PDA培养基上活化，于25℃下培养10d，用直径4mm的打孔器在长势一致的菌落边缘打取菌饼，每瓶接种5块菌饼，在黑暗条件下，25℃、120r/min摇床振荡培养。培养第3、5、7、10、15、21、25、30d每种培养液每次分别取3瓶。将培养液通过双层灭菌滤纸过滤除去菌丝体，后用0.22μm微孔滤膜加压抽滤，获得无菌滤液，即多主棒孢菌粗毒素滤液。-4℃冰箱中保存备用。

1.3 黄瓜多主棒孢菌粗毒素生物活性的测定

1.3.1 对黄瓜种子的活性 采用种子萌发生长法测定粗毒素滤液对黄瓜种子的活性。选择中农5号黄瓜品种，将50粒黄瓜种子置于铺有双层灭菌滤纸的培养皿内，分别加入不同处理获得的粗毒素滤液5mL，以加无菌水为空白对照。每处理3皿。在28℃培养箱中催芽36h，统计种子发芽情况，测量芽长，计算发芽率。

1.3.2 对黄瓜离体叶片的活性 ①叶片萎蔫法。取20mL烧瓶，分别加入各处理获得的粗毒素滤液5mL，将采集的同一生长期的黄瓜叶片浸入滤液中，以浸入5mL无菌水为空白对照。每处理重复3瓶。25℃培养箱中培养3d（光周期为12h）。毒素作用会使黄瓜叶片发生萎蔫，通过叶片干重和湿重的百分比，来确定毒素作用导致叶片的萎蔫程度。萎蔫强度（%）=（处理的干重湿重百分比-对照的干重湿重百分比）/对照的干重湿重百分比×100。

②叶片圆盘法。将采集的同一生长期的黄瓜叶片用直径1cm的打孔器打取叶盘，然后每20个叶盘为一个重复，立即浸入含有10mL多主棒孢粗毒素滤液的直径为9cm的培养皿中（将叶盘背面朝下），以浸入10mL无菌水为空白对照。每处理重复3次。25℃培养箱中培养3d（光周期为12h）。毒素作用会使黄瓜叶盘褪绿变黄，通过叶盘的变黄程度来衡量毒素活性。

③毒素悬滴接种叶片法。采集同一生长期的黄瓜叶片，将其放在铺有两层浸湿滤纸的大培养皿中，在黄瓜叶片背面左右两侧悬滴接种20μL粗毒素滤液，以接种20μL无菌水为空白对照。每处理重复3皿，每皿放入1片黄瓜叶片。25℃培养箱中培养3d（光周期为12h）。毒素作用会使黄瓜叶片自接种点位置褪绿变黄，采用十字交叉法测定形成的圆形病斑大小，通过病斑面积、接种点叶片变黄程度衡量毒素活性大小。

2 结果与分析

2.1 菌株粗毒素滤液对黄瓜种子生长的抑制作用

该病原菌在4种培养基中均能正常生长，其中在PD液体培养基中菌丝生长较快，培养10d后菌丝量较多，培养滤液显著少于其它培养基，菌丝聚集缠绕形成较大的菌球。在其它3种培养基中，菌丝生长缓慢，形成较小的菌丝球。

通过不同培养基、不同时间收集的定量培养滤液对黄瓜种子萌发和胚芽生长的影响试验测定发现，不同培养基处理的出芽率和芽长随培养时间的增长均呈现先减少再增加的趋势，其中改良Fries培养基和Richard培养基处理在培养15～21d、PD培养基培养基处理在培养10～15d、改良Czapek培养基处理在培养21～25d最低。在所有处理中，PD培养基培养的多主棒孢菌产生的毒素滤液对黄瓜种子萌发和生长的抑制作用相对较小，改良Czapek培养基培养的多主棒孢菌培养滤液对黄瓜种子萌发生长的影响最为显著，在培养的21d滤液毒素浓度最大，抑制作用最强（表1）。

2.2 叶片萎蔫法测定粗毒素滤液对黄瓜离体叶片的活性

4种培养基在不同培养时间产生的滤液对黄瓜离体叶片的萎蔫强度比较试验结果（表2）发现，毒素滤液可使黄瓜叶片的萎蔫强度显著增加，经清水对照处理的叶片萎蔫强度在10%左右，而粗毒素培养滤液处理后萎蔫强度可达18%左右。其中，各培养基处理叶片萎蔫强度随培养时间的增长均呈现先增高后降低的趋势，改良Fries培养基和Richard培养基处理在培养21d、PD培养基培养基处理在培养15d、改良Czapek培养基处理在培养25d最低。在所有处理中，改良Czapek培养基培养的多主棒孢菌在第25d产生的毒素滤液活性最大，达18.380%，显著高于其它培养基产生的滤液活性。

2.3 叶片圆盘法测定粗毒素滤液对黄瓜离体叶片的活性

利用不同培养基和培养时间获得的粗毒素滤液侵泡叶盘，在多主棒孢菌培养5d后PD和改良Czapek培养基获得的粗毒素滤液对处理的黄瓜叶盘出现毒害作用，使其褪绿变黄；而改良Fries培养基和Richard培养基培养7d后获得的粗毒素滤液对黄瓜叶盘产生毒害作用，说明其产生的毒素活性弱于PD和改良Czapek培养基获得的毒素滤液。第15d时4种培养基获得的毒素滤液均产生显著的毒害作用（表3）。

2.4 毒素悬滴接种叶片法测定粗毒素滤液对黄瓜离体叶片的活性

多主棒孢菌液体培养7d的毒素滤液悬滴接种黄瓜叶片，在接种后第5d调查时均未有发病症状，毒素滤液对黄瓜叶片不具有毒害作用。培养10d后的滤液悬滴接种黄瓜离体叶片时，在第5d观察时表现出接种点褪绿变黄，发病面积小于1cm²，产生较小毒害作用。培养15～30d后产生的毒素滤液对黄瓜离体叶片的毒害作用较强，产生面积较大的毒素侵染斑（表4）。

3 结论与讨论

本试验结果说明，多主棒孢菌产毒能力与其培养基成分密切相关，在改良Czapek培养基中培养产生毒素的活性最高，可作为其最适培养基；在PD培养基中产毒活性较低，但菌丝生长量最大，更适合该病原菌的营养繁殖。在相同培养条件下，培养时间对毒素活性也具有显著影响，改良Czapek培养基中培养21～25d，产毒活性最大，培养时间过长对毒素活性具有抑制作用。种子萌发生长法和叶片萎蔫度法均可对毒素活性进行量化比较，而叶盘法及悬滴接种法主要通过症状观察衡量毒素活性强弱，因此笔者认为在粗毒素产生条件的筛选试验中，在获得的毒素浓度有限的条件下，种子萌发生长法和叶片萎蔫度法两种活性测定方法更适用。