不同苜蓿材料对木贼镰刀菌根腐病的抗病性评价

辛宝宝, 袁庆华, 王 瑜, 马甲强

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193)



不同苜蓿材料对木贼镰刀菌根腐病的抗病性评价

辛宝宝, 袁庆华*, 王 瑜, 马甲强

(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所, 北京 100193)

采用土壤接菌法,对60份紫花苜蓿(Medicagosativa)种质材料进行了苗期抗根腐病性状评价。在测定供试苜蓿材料的发病率、病情指数、株高、地上生物量和地下生物量指标的基础上,利用隶属函数法对其进行了抗病性综合评价。结果表明:接种木贼镰刀菌(Fusariumequiseti)后,抗镰刀菌根腐病较强的紫花苜蓿种质材料是来自陕西乾县的0060、美国的88-33(‘维多利亚’)、日本的85-47(‘GT49R’)和甘肃西峰的0782等;抗病性较差的材料有来自美国的88-45(‘马里科巴’)、北京的2758(‘中苜一号’)、内蒙古准格尔的2738和拉达克的0215等;其他材料抗病性居中。

紫花苜蓿; 木贼镰刀菌; 抗病性

紫花苜蓿(Medicagosativa)是全世界最重要的豆科牧草,被誉为“牧草之王”。苜蓿根腐病(alfalfa root rot)是苜蓿生产上一种毁灭性的真菌土传病害,常导致苜蓿产量大幅下降、品质降低,严重影响苜蓿的广泛应用[1],成为限制苜蓿产业开发和生态建设的主要因素[2]。许多研究表明多种镰刀菌(Fusariumspp.)可单独或复合侵染导致苜蓿根腐病的发生,而且不同国家和地区报道的优势镰刀菌种类并不完全相同[3-4]。李丹[5]在对甘肃省中西部地区镰刀菌的分类研究中发现,862个供试菌株中分离频率最高的是木贼镰刀菌(Fusariumequiseti),占鉴定菌株总数的29.93%,是甘肃省主要优势镰刀菌。

木贼镰刀菌是一种世界性的土壤真菌[6],通过入侵根部成为优势种,以破坏维管束组织来减少和阻止根部内生真菌的联合[7]。在植株发育的各个时期只要条件适合,均可侵染寄主,引起根腐病[8-9]。选用抗病品种是防治该病的重要措施[10]。多年来,国内外学者在评价苜蓿对根腐病的抗性方面做了大量研究[11-12], Michaud等在加拿大魁北克地区评价了14个苜蓿品种对根腐病的田间抗性及其抗性差异[13]。李敏权[14]对苜蓿根和根颈腐烂病病原菌及20份苜蓿品种的抗病性进行了研究。刘海波[15]利用病原菌毒素筛选抗根腐病苜蓿。尽管目前还没有培育出抗根腐病的高抗品种,但品种间具有明显的抗病差异。本研究选用国内外60份苜蓿种质材料,分别测定了其发病率、病情指数、株高、地上生物量和地下生物量,采用隶属函数法评价接种木贼镰刀菌后苜蓿的抗病表现，为紫花苜蓿抗根腐病种质材料的筛选提供可借鉴的指标和评价方法,同时为苜蓿抗根腐病育种、栽培提供材料和理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试苜蓿材料

供试苜蓿材料由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所提供,材料名称及来源见表1。

1.1.2 供试菌株

供试菌株为木贼镰刀菌(Fusariumequiseti),从廊坊基地苜蓿上分离获得,纯化的菌株在PDA平板上培养10 d后于4℃保存备用。

1.2 方法

1.2.1 接种体的制备

将保存的菌株接种于PDA培养基上,25℃恒温培养7 d,然后在无菌条件下用手术刀轻轻刮下菌丝和分生孢子,置于装有灭菌水的三角瓶内,充分振荡,使孢子脱离菌丝,制成孢子浓度为1×105个/mL的悬浮液,供接种使用[2]。

称取50 g大米45份,分别置于直径15 cm的培养皿中,每皿加150 mL水,经蒸汽灭菌(121℃温度下30 min)后,冷却至室温,然后每皿加入孢子悬浮液20 mL,与米粒混合均匀,在25℃下培养4 d。

1.2.2 育苗和接种

选取健康的紫花苜蓿种子,用0.1%升汞进行消毒,将消毒后的苜蓿种子摆放在无菌培养皿内湿润的滤纸上,放入20℃的生长箱内发芽2 d,待幼根长到1 cm时,移到装有灭菌土壤的花盆(高9 cm,底径7.5 cm,口径11 cm)中,然后放入15～25℃的温室中培养,45 d后进行病菌接种。每盆10株,3个重复。

将制备好的木贼镰刀菌米粒接种体放在幼苗周围的土壤表面,然后用无菌土覆盖,每盆接种量为每皿米粒接种体的1/4,以接种等量的无菌米粒为对照。接菌后浇足水,放在25℃温室中培育。7 d后调查发病率。14 d后对根部进行病情分级调查,计算发病率和病情指数,并测定株高、地上及地下生物量。

1.3 指标测定及方法

1.3.1 发病率及病情指数

根颈部病情分级标准参考黄宁等[10]、李敏权[16]的分级标准:0级,健康无病;1级,根颈部出现黑色斑点;2级,根颈被黑色病斑包围;3级,根颈有缢缩现象,出现枯叶;4级,根颈严重缢缩,叶片全部干枯,侧根减少;5级,根颈部全部腐烂,无侧根,整株枯死。

1.3.2 幼苗株高的测定

株高为每盆10株苗的平均值。为了消除材料本身的误差,用相对株高作为衡量材料对尖孢镰刀菌抗性能力的指标。

1.3.3 地上部分生物量的测定

用剪刀沿土层割取植株地上部,用自来水冲洗干净后放入烘箱中,105℃杀青,80℃下过夜(12 h),在干燥器中冷却到室温后用天平称重(精确到0.001)。以每盆中所有植株地上部分的总干重作为材料的地上部分生物量。

相对地上生物量干重(%)=

1.3.4 地下部分生物量的测定

从已测定地上部分生物量的盆中挖取样品,用流水冲洗直至把泥土全部冲洗干净,放入80℃烘箱烘干24 h至恒重,冷却至室温称重量(精确到0.001)。

相对地下生物量干重(%)=

1.4 抗根腐病综合评价

抗根腐病综合评价采用隶属函数标准差系数赋予权重法。单项指标抗病系数计算公式如下:

单项指标的抗病性系数(%)=

运用SAS 8.0对单项指标的抗病性系数进行方差分析。

1.4.1 数据标准化

运用隶属函数对各指标进行标准化处理。

(1)

(2)

式中,μ(X)表示隶属函数值;Xj表示第j个综合指标值;Xmin表示第j个综合指标的最小值,Xmax表示第j个综合指标的最大值,当指标与抗病性呈正相关用隶属函数公式(1)计算隶属函数值,当指标与抗病性呈负相关用隶属函数公式(2)计算隶属函数值。

1.4.2 采用标准差系数法

用公式(3)计算标准差系数Vj,归一化后得到各指标的权重系数Wj,见公式(4)。

(3)

(4)

1.4.3 抗根腐病综合评价

用公式(5)计算各材料的综合评价值。

(5)

式中,D为各材料在接种木贼镰刀菌后用综合指标评价所得的抗病性综合评价值。根据D对供试材料抗病性强弱进行排序。

2 结果与分析

2.1 不同苜蓿材料接种木贼镰刀菌后的发病率和病情指数

从表1中可以看出,不同材料间对根腐病抗性存在显著差异(P<0.05)。从发病率来看,供试材料的发病率在6.67%～86.67%之间,其中发病率在20%以下的有6份材料,发病率最低的是来自陕西长武的材料0208,发病率只有6.67%,其次是来自于秘鲁的‘478572’(92-203)和来自加拿大的‘苏普斯坦’(83-130),发病率为13.33%,而发病率达到80%的有3份材料,分别是来自美国的‘维多利亚’(88-33)、吉林的‘公农2号’(0063)和俄罗斯的‘苏联2号’(0731)。各材料的病情指数变化范围在22.67～81.11之间,从中可以看出无免疫和高抗材料; 病情指数在30以下有4份材料,占总材料的6.67%,其中来自于秘鲁的‘478572’(92-203)和陕西长武的0208的病情指数较低,分别为22.67和23.33,表现出对苜蓿根腐病较强的抗病性;病情指数在70以上的有7份材料,占总材料的11.67%,其中来自日本的‘GT13R’(85-48)和吉林的‘公农2号’(0063)病情指数最高均为81.11,对苜蓿根腐病表现为高感。

2.2 不同苜蓿材料接种尖孢镰刀菌后的株高及生物量

受木贼镰刀菌侵染后,60份紫花苜蓿材料的相对株高、相对地上生物量和相对地下生物量呈现下降趋势,并且不同材料间存在显著差异(P<0.05)。各材料间相对株高的变幅在3.95%～49.75%之间,相对株高≥90%的有7份材料,占总材料的11.67%,其中来自宁夏同心的2759的相对株高在95%以上;相对株高≤60%的有6份材料,占总材料的10.0%,其中来自甘肃西峰的0782和陕西的‘沂阳’(0058)相对株高最低,分别为50.25%和54.39%;大部分材料的相对株高在60%～90%之间,总共有47份材料,占总材料的78.33%。

从表1可以看出,各材料相对地上生物量的下降幅度为6.14%～81.39%之间。相对地上生物量降幅在20%以下的有8份材料,占总材料的13.33%,其中只有1份材料降幅在小于10%,是来美国的‘牧歌401+2’(2005-3),降幅为6.14%。相对地上生物量降幅高于70%的有5份材料,占总材料的8.33%,其中有2份材料高于80%,是来自美国的‘维多利亚’(88-33)和‘马里科巴’(88-45),降幅分别为81.39%和80.95%;其他材料的相对地上生物量降幅均在20%～70%之间,总共47份材料,占总材料的78.34%。

各材料间相对地下生物量的变幅在1.02%～89.06%之间(表1),相对地下生物量降幅在10%以下的有7份材料,占总材料的11.67%,其中陕西乾县的0060和长武的0208降幅最小,分别为1.02%和1.55%。相对地下生物量降幅在70%以上的材料有4份,占总材料的6.67%,来自美国的‘马里科巴’(88-45)降幅最大,为89.04%;而其他49份材料的相对地下生物量降幅在40%～80%之间,占总材料的81.66%。

综上可以得出,用同一指标分析得到的各苜蓿材料对木贼镰刀菌的抗病性强弱程度各异;同一种质不同指标的抗病性系数并不完全一致,甚至有较大的差距。所以,用任何单一指标来评价苜蓿对木贼镰刀菌的抗病性都存在片面性和不稳定性,必须用多个指标进行综合评价才较为可靠。

表1 紫花苜蓿接种木贼镰孢菌后各指标的抗性系数1)Table 1 Resistance coefficients of indices of alfalfa materials to Fusarium oxysporum after inoculation

续表1 Table 1(Continued)

材料编号Accessioncode品种名Variety来源地Origin抗性系数/% Resistancecoefficient发病率Infectionrate病情指数Diseaseindex相对株高Relativeplantheight相对地上部干重Relativeabovegroundbiomass相对地下部干重Relativeundergroundbiomass0649-法国50.0046.2263.8648.2930.430710-新疆乌鲁木齐73.3367.7863.0287.1144.200731-陕西兴平80.0072.7880.6977.1336.940725苏联2号俄罗斯63.3366.1157.7133.7835.900782-甘肃西峰76.6775.5650.2523.4197.951894-法国33.3350.7880.4280.7087.482712新疆大叶新疆56.6763.8981.2150.0052.832718甘农2号甘肃43.3354.4486.7144.4439.472736-江苏淮阴26.6744.6775.1741.8870.072738-内蒙古准格尔36.6756.6769.6349.8119.442758中苜一号北京30.0058.8984.7327.4619.522759-宁夏同心26.6730.6796.0563.9181.882828龙牧806号黑龙江50.0057.7890.6756.2057.72F值FvalueP11.66P<0.0512.80P<0.0512.23P<0.0513.43P<0.0520.33P<0.05

1) “-”表示该材料无品种名,F值表示材料间差异显著(P<0.05)。下同。

“-”means the germplasm materials without variety name. TheFvalue showed significant difference between different materials at the 0.05 level.The same below.

2.3 苜蓿对木贼镰刀菌的抗病性评价

为了能够比较全面地反映不同苜蓿种质材料对木贼镰刀菌的抗病性,本文以发病率、病情指数、株高、地上生物量和地下生物量共5个指标为依据,采用隶属函数法结合各指标的权重系数,综合评价了苜蓿材料对木贼镰刀菌的抗病性。D值代表各材料对木贼镰刀菌的抗病性强弱,D值越大,表明其抗病性越强。由表2 可以看出,来自陕西乾县的0060、美国的‘维多利亚’(88-33)、日本的‘GT49R’(85-47)和甘肃西峰的0782的D值较大,表明这4份材料对木贼镰刀菌的抗病性较强。而来自美国的‘马里科巴’(88-45)和来自北京的‘中苜一号’(2758)的D值较小,表明这些材料对木贼镰刀菌的抗病性较弱。其他材料的抗病性居于中间。

表2 紫花苜蓿材料苗期各指标隶属函数值与D值Table 2 Subordinate function and D value of index of the different materials in the seedling stage

续表2 Table 2(Continued)

材料编号Accessioncode品种名Variety隶属函数Subordinatefunctionμ(1)μ(2)μ(3)μ(4)μ(5)D值Dvalue排序Order88-44PG塞特0.2920.2090.4710.7910.9190.3173188-45马里科巴0.6670.0760.1660.0060.0000.1486089-10巴隆0.2920.4180.6990.8420.9830.3901089-12先锋5330.4580.4090.4230.3530.3870.2764692-2034785720.0831.0000.8530.7990.7780.393994-31FRLUI10.5830.2850.6430.7910.6980.351232005-2皇冠0.7500.4280.3820.3590.2540.309332005-3牧歌401+20.4170.6750.5691.0000.6560.365170058-0.3750.4180.0900.3790.3940.259520059-0.3750.4850.6370.4620.3360.273470060-0.1670.9810.8810.6851.0000.42710062-0.5000.3990.5520.6010.8450.386130063公农2号0.9170.0000.7160.1800.5560.301380128公农1号0.5000.3800.8120.4400.4310.295400130-0.6670.2660.8680.8480.8140.39770131-0.6250.3710.4740.8440.7090.377150171-0.7920.3710.9110.6480.3030.332260208-0.0000.9720.8850.7280.9940.39380215-0.2500.2090.5250.5840.5720.233570269兰花苜蓿0.5000.4180.2190.6010.5610.322270332-0.4580.3800.2130.2540.6430.319290425-0.5000.4280.6360.1770.2870.266500440-0.3750.6840.4980.4100.8220.379140456-0.6250.4560.2720.6130.7490.39760469-0.1670.4470.4230.6390.5740.273480470-0.5830.4470.3310.4290.3040.292410629-0.5000.4370.4770.3810.7090.360200632-0.4580.3800.5420.4700.8370.368160648普罗旺斯0.7500.2470.6410.3340.3090.280430649-0.5420.5970.2970.3940.2210.276450710-0.8330.2280.2790.9100.3780.308340731-0.9170.1430.6650.7780.2950.297390725苏联2号0.7080.2570.1630.2020.2830.261510782-0.8750.0950.0000.0640.9880.40241894-0.3330.5190.6590.8250.8690.388112712新疆大叶0.6250.2950.6760.4170.4760.305362718甘农2号0.4580.4560.7960.3430.3240.279442736-0.2500.6240.5440.3090.6720.319282738-0.3750.4180.4230.4150.0960.202582758中苜一号0.2920.3800.7530.1180.0970.173592759-0.2500.8631.0000.6020.8060.386122828龙牧806号0.5420.3990.8820.5000.5310.33225

3 讨论与结论

本文对60份苜蓿材料接种木贼镰刀菌后发病率、病情指数、株高、地上生物量和地下生物量5个指标的分析比较得出,苜蓿对根腐病的抗病性和其他作物一样,不同性状反映出的抗病性强弱程度各异,同一材料不同指标的抗病性系数并不完全一致,甚至有较大的差距[13-14]。所以,用任何单一指标来评价苜蓿对木贼镰刀菌的抗病性都存在片面性和不稳定性,用多个指标进行综合评价才较为可靠。因此本文采用与抗病性密切相关的指标,即发病率、病情指数、株高、地上生物量和地下生物量来作为各苜蓿材料抗病性鉴定指标。

传统上主要根据发病率、病情指数和存活率划分抗病等级来评价苜蓿对根腐病的抗病性强弱。在前人的研究中,由于选择的材料范围、指标性状、材料份数、分析方法和划分标准不尽相同,因此得出的结果往往不一致, Hwang等[16]和李敏权[17]根据发病率将紫花苜蓿根腐病抗性划分为3级。郭玉霞等[18]等根据苜蓿病情指数将抗病性划分为5级, Michaud等[15]用到了十二级病害分级标准,可比性较差。林汉明等[19]、陈德明等[20]等认为,当鉴定材料数量较多,抗逆性的指标亦较多,各指标在综合评价时的重要性不同，且指标间又存在着一定的相关性时,供试材料对逆境反映的信息发生交叉与重叠,此时采用隶属函数法可将各指标的抗病性系数转换成相互独立的综合指标,以D值作为材料抗病性的综合评价指标,因为D值是个[0,1]闭区间上的纯数,消除了个别指标带来的片面性,既考虑了各指标间的相互关系,又考虑到各指标的重要性,具有可比性。所以根据D值的大小就可以较准确地评价各苜蓿材料对木贼镰刀菌的抗病性,各苜蓿材料的抗病性差异也具有可比性。该方法已在胡麻[21]、小麦[22]、花生[23]、油菜[24]等作物的抗逆性上应用,取得了比较理想的结果。

本研究采用此方法得出苜蓿材料对木贼镰刀菌抗性较好的材料是来自陕西乾县的0060、美国的86-33(‘维多利亚’)、日本的85-47(‘GT49R’)和甘肃西峰的0782;抗病性较弱的材料是来自美国的88-45(‘马里科巴’)和来自北京的2758(‘中苜一号’)。

[1] 李敏权, 柴兆祥, 李金花, 等. 定西地区苜蓿根和根颈腐烂病病原研究[J]. 草地学报, 2003, 11(1): 83-86.

[2] 丁守彦, 李敏权, 赵慧. 不同苜蓿品种对镰孢菌的抗性鉴定[J]. 植物保护, 2011, 37(1): 110-114.

[3] Hawn E J. Studies on the epidemiology of crown bud rot of alfalfa in southern Alberta[J]. Canadian Journal of Botany, 1958, 36(2): 239-250.

[4] Turner V, van Alfew N K. Crown rot of alfalfa in Utah [J]. Phytopathology, 1983, 73: 1333-1337.

[5] 李丹. 甘肃省中西部地区镰孢菌的分类研究[D]. 兰州:甘肃农业大学, 2008: 01-02.

[6] Saremi H, Burgess L W, Backhouse D. Temperature effects on the relative abundance ofFusariumspecies in a model plant-soil ecosystem[J]. Soil Biology and Biochemistry, 1999, 31(7): 941-947.

[7] McAllister C B, Garcia-Garrido J M, Garcia-Romera I, et al. Interaction betweenAlternariaalternataorFusariumequisetiandGlomusmosseaeand its effects on plant growth [J]. Biology and Fertility of Soils, 1997, 24(3): 301-305.

[8] Johnson G I. Brown etch or zonate ring spot of butternut gramma [J]. Australian Plant Pathology Society Newsletter, 1976, 5(4): 48.

[9] Elmer W H.Fusariumfruit rot of pumpkin in Connecticut [J]. Plant Disease, 1996, 80(2): 131-135.

[10]黄宁, 孙鑫博, 王铁梅, 等. 62个苜蓿品种抗根腐病评价及抗病评价标准品种的筛选[J]. 中国草地学报, 2013, 35(1):12-17.

[11]Miller-Garvin J E, Viands D R. Selection for resistance toFusariumroot rot, and associations among resistances to six diseases in alfalfa [J]. Crop Science, 1994, 34(6): 1461-1465.

[12]Emberger G, Welty R E. Evaluation of virulence ofFusariumoxysporumf.sp.medicaginisand fusarium wilt resistance in alfalfa [J]. Plant Disease, 1983, 67(1): 94-98.

[13]Michaud R, Richard C. Evaluation of cultivars for reaction to crown and root rot[J]. Canadian Journal of Plant Science, 1985, 65(1): 95-98.

[14]李敏权. 苜蓿根和根颈腐烂病病原致病性及品种抗病性研究[J]. 中国草地, 2003, 25(1): 39-43.

[15]刘海波. 利用病原菌毒素筛选抗苜蓿根腐病的研究[D]. 重庆: 西南大学, 2006: 01-04.

[16]Hwang S F, Gossen B D, Turnbull G D, et al. Seedbed preparation, timing of seeding, fertility and root pathogens affect establishment and yield of alfalfa [J]. Canadlan Journal of Plant Science, 2002, 82(2): 371-381.

[17]李敏权. 苜蓿根和根颈腐烂病的病原及种质抗病性研究[D]. 兰州:甘肃农业大学, 2002.

[18]郭玉霞, 南志标, 李春杰, 等. 黄土高原区苜蓿与小麦轮作系统根部入侵真菌研究[J]. 生态学报, 2004, 24(3): 486-494.

[19]林汉明, 常汝镇, 邵桂华, 等. 中国大豆耐逆研究[M]. 北京: 中国农业出版社, 2009.

[20]陈德明, 俞仁培, 杨劲松．盐渍条件下小麦抗盐性的隶属函数值法评价[J]. 土壤学报, 2009, 39(3): 368-374.

[21]祁旭升, 王兴荣, 许军, 等. 胡麻种质资源成株期抗旱性评价[J]. 中国农业科学, 2010, 43(1): 3076-3087.

[22]陈荣敏, 杨学举, 梁凤山, 等. 利用隶属函数法综合评价冬小麦的抗旱性[J]. 河北农业大学学报, 2002, 25(2): 7-9.

[23]张智猛, 万书波, 戴良香, 等. 花生抗旱性鉴定指标的筛选与评价[J]. 植物生态学报, 2011, 35(1): 100-109.

[24]谢小玉, 张霞, 张兵. 油菜苗期抗旱性评价及抗旱相关指标变化分析[J]. 中国农业科学, 2013, 46(3): 476-485.

(责任编辑：杨明丽)

Evaluation on resistance of different germplasms of alfalfa toFusariumequiseti

Xin Baobao, Yuan Qinghua, Wang Yu, Ma Jiaqiang

(Institute of Animal Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

The infection rate, disease index, plant height, aboveground biomass and underground biomass of sixty kinds of alfalfa germplasms at seedling stage were investigated after soil inoculation. The resistances of sixty alfalfa cultivars toFusariumequisetiwere comprehensively analyzed by subordinative function. The results indicated that after inoculatingF.equiseti, 0060,88-33 (‘Victoria’),85-47 (‘GT49R’) and 0782 materials were highly resistant and 88-45(‘Maricopa’), 2758(‘Zhongmu No.1’), 2738 and 0215 materials were highly susceptible, and other materials were moderately resistant.

alfalfa;Fusariumequiseti; resistance

2015-10-19

2015-12-11

农业部物种资源保护财政专项(2130135)；公益性行业(农业)科研专项(201303057)

S 435.4

A

10.3969/j.issn.0529-1542.2016.05.028

* 通信作者 E-mail: yuanqinghua@hotmail.com