TLC-SERS法快速分析抗精神失常类中药的化药成分

2016-12-06 10:25陈梦云许激扬
实验室研究与探索 2016年5期
关键词:舒必利卡马西平利培

王 磊, 陈梦云, 李 晓, 陆 峰, 许激扬

(1. 中国药科大学 生化教研室,江苏 南京 210009;2. 第二军医大学 药分教研室,上海 200433)



TLC-SERS法快速分析抗精神失常类中药的化药成分

王 磊1, 陈梦云2, 李 晓2, 陆 峰2, 许激扬1

(1. 中国药科大学 生化教研室,江苏 南京 210009;2. 第二军医大学 药分教研室,上海 200433)

建立了一种薄层色谱(TLC)结合表面增强拉曼光谱(SERS)用于快速检测抗精神失常类中药中非法掺杂化学成分的方法。通过优化银溶胶、动态-表面增强拉曼光谱(D-SERS)检测方法及激光强度等因素后,利用TLC对中药基质和掺伪4种化药成分,即奋乃静、卡马西平、利培酮、舒必利进行初步分离,以三氯甲烷∶甲醇∶水(8∶2∶0.2)为展开剂,于254 nm紫外灯下检视定位,进而使用SERS技术对分离的微量物质进行鉴别。结果表明,该方法具有专属性、灵敏度好等特点,且检测限可低至0.02 mg/mL;与HPLC法相比,该方法简单快速,无需样品前处理,在现场快速检测方面具有广阔的应用前景。

表面增强拉曼光谱; 薄层色谱; 中药; 非法添加

0 引 言

近年来,中药制剂及中药材掺假的现象屡有发生,不法商贩为了牟取暴利,向其中非法添加功效相近的化药成分[1]。由于非法添加物的不确定性,患者长期服用这种含有化药成分的中药,极易导致严重的不良反应。例如向清热类中药中掺杂化药成分可能会导致皮疹、皮炎、哮喘,甚至黏膜脱落等不良症状;而向抗精神失常类药物中非法添加化药成分,更容易导致患者出现眩晕、呕吐、言语障碍的症状,甚至引起智力和性格的改变。目前,对于中药掺杂化药成分的主要检测方法包括:高效毛细管电泳法(HPCE)[2]、高效液相法(HPLC)[3]、液质联用法(LC-MS)[4]等,然而这些方法虽然准确性好、灵敏度高,但分析周期长、检测成本高,大多局限于实验室使用,不能很好适用于现场检测,甚至快检分析。然而,薄层色谱-表面增强拉曼联用技术(TLC-SERS)作为近十几年来发展的一种新型分析技术,可以有效地克服此类问题。TLC法可以用于复杂样品的分离,具有简单、经济、高效的特点;此外,SERS能够提供精细的样品分子振动指纹图谱,更可以使拉曼散射信号增强104~106倍[5],具有灵敏度高、专属性好的优点。由此可见,TLC与SERS联用,能够有效地将两者优势结合起来,对中药复杂体系进行简单的分离,进而利用SERS法实现待测物的定性鉴别,达到现场高效检测的目的[6]。目前TLC-SERS联用分析技术已被广泛的应用于各种领域,如生物血液中吗啡[7]、水中污染物[8-9]、中成药中掺杂西药成分[10]等方面的研究。

本研究建立了基于TLC-SERS联用技术快速检测抗精神失常类中药中非法添加奋乃静、卡马西平、利培酮、舒必利4种化药成分的方法,并对使用的薄层展开条件、银溶胶等因素进行了优化,为快速检测抗精神失常类药物中非法添加化药成分提供了一种新方案,同时为药品监管部门检测中药真伪提供了有力保障。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

便携式拉曼光谱仪(BWS415),激发功率300 mW,分辨率3 cm-1,激发波长785 nm;扫描电子显微镜(SEM)(Zeiss EVO MA-10 Carl-Zeiss, Germany);WFH-203B型三用紫外分析仪(上海精科实业有限公司);普析通用TU-1901双光束紫外可见分光光度计; KQ-250DB型数控超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司);离心机(TG16-WS,上海卢湘仪离心机有限公司)。

对照品舒必利(批号:100203-200503)、利培酮(批号:00570-201102)、奋乃静(批号:100133-200602)、卡马西平(批号:100142-201105)均购自中国食品药品检定研究院;硝酸银、三水合柠檬酸三钠、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP-K30)(分析纯,国药集团化学试剂有、限公司);实验用水为二次蒸馏水;薄层板HSGF254(烟台江友硅胶开发有限公司);其他试剂均为分析纯,购自国药集团化学试剂有限公司;实验中抗精神失常中成药样品均由山东省食品药品检验所提供。

1.2 实验方法

(1) 银溶胶的制备。

DMF银溶胶的制备:将10 mL的PVP-硝酸银溶液(PVP 9 mg、硝酸银0.02 mol/L)加入到100 mL沸腾的DMF中,继续加热一段时间,当溶液由无色最终变为黄棕色停止加热,取出冷却,制得DMF银溶胶,备用。

乙二醇还原法制备银溶胶:精密称定PVP(Mw=55 000)2.5 g、硝酸银0.5 g溶于200 mL乙二醇中,机械搅拌下加热至130 °C并维持1 h,待溶液变为黄绿色粘稠状时停止反应,冷却至室温。将反应得到的银溶胶用800 mL丙酮离心洗涤后重新分散于200 mL去离子水中,制得乙二醇还原法银溶胶,备用。

(2) 样品溶液的配制。称取适量舒必利、利培酮、奋乃静、卡马西平对照品,加入甲醇溶解,分别配成1 mg/mL的对照品溶液,备用。

取某抗精神失常类中成药样品适量,研细,精密称取舒必利、利培酮、奋乃静、卡马西平适量加入其中,使各成分的添加量均为1%(质量百分比),加入甲醇溶解,超声20 min,10 000 r/min离心20 min,取上清液作为模拟阳性样品溶液,备用。

取真实样品适量,研细,加入1 mL甲醇溶解,超声20 min,10 000 r/min离心20 min,取上清液作为真实样品溶液,备用。

(3) 对照品原位SERS采集。分别取舒必利、利培酮、奋乃静、卡马西平对照品适量,在积分时间15 s、激光强度80%且点胶量5 μL的条件下使用便携式拉曼仪进行检测,每种样品采集20条光谱,将20条光谱的平均光谱作为每个样品的最终光谱,即可得到4种对照品的原位SERS图谱。

(4) TLC-SERS检测方法。分别吸取对照品溶液、阴性对照品溶液、模拟阳性对照品溶液各1 μL,点于同一硅胶板上,展开剂条件为三氯甲烷∶甲醇∶水(8∶2∶0.2),展开后晾干,置于254 nm紫外下检视定位。于对照品色谱条带的斑点处和模拟阳性对照品中相同Rf值处分别滴加5 μL银溶胶,滴加银溶胶的位置进行检测,激光强度160 mW,积分时间15 s,每种样品采集20条光谱,将20条光谱的平均光谱作为每个样品的最终光谱,即可得到对应的SERS图谱。取5 μL的银溶胶滴于空白硅胶板上,以相同的条件进行检测,类似地,获得银溶胶的空白对照图谱。

2 结果与讨论

2.1 薄层色谱条件的优化

实验中对展开剂进行了考察与优化,主要考察了乙酸乙酯∶乙醇∶水(7∶3.0∶0.2)和三氯甲烷∶甲醇∶水(8∶2.0∶0.2)两种展开剂的展开效果。以乙酸乙酯∶乙醇∶水(7∶3.0∶0.2)为展开剂体系时,分离效果并不理想,各物质的比移值接近,出现斑点重叠,甚至拖尾现象。而采用三氯甲烷∶甲醇∶水(8.0∶2.0∶0.2)作为展开剂体系时,4种物质的分离效果较好且无拖尾现象,舒必利、奋乃静、利培酮、卡马西平的Rf值分别为0.37、0.72、0.81、0.90,如图1所示。因此最终采用三氯甲烷∶甲醇∶水(8.0∶2.0∶0.2)作为展开剂。

1-阴性对照品,2-模拟阳性样品,3-舒必利,4-奋乃静,5-利培酮,6-卡马西平

图1 模拟阳性样品和4种对照品的薄层色谱图

2.2 银溶胶的考察与选择

本实验以不同的方法制备了两种纳米银溶胶[11-12],并对两种银溶胶的SERS增强效果进行了对比考察,结果如图2所示。由图2可知,以乙二醇作为还原剂制备的银溶胶对4种对照品的增强效果均低于以DMF为还原剂和溶剂制备的银溶胶,实验中对乙二醇还原制备的银溶胶进行了浓缩处理,并使用硝酸钾、氯化钾等作为凝聚剂,均未能取得理想的增强效果。SERS增强效果的强弱取决于SERS‘热点’的形成及待测物分子与‘热点’的距离,当待测物分子无法有效接近‘热点’区域时,SERS增强效果就会降低。本实验中乙二醇还原制得的纳米银溶胶分散于水中,而4种对照品均不溶于水,所以不能有效地接近纳米银粒子之间形成的SERS‘热点’,可能导致乙二醇还原制备的银溶胶增强效果较差。以DMF为还原剂和溶剂可以制备有机相纳米银溶胶,4种疏水性的对照品均能有效地接近有机相银溶胶形成的‘热点’,故可以得到较好的SERS增强效果。因此,最终选择以DMF作为还原剂和溶剂制备的有机相纳米银溶胶。

(a)奋乃静(b)舒必利(c)利培酮(d)卡马西平

a-DMF为还原剂,b-乙二醇为还原剂

图2 两种银溶胶检测4种对照品的SERS图

2.3 银溶胶的SEM与紫外表征

采用DMF为还原剂和溶剂、PVP为稳定剂还原硝酸银,成功地合成出了银纳米粒子。溶液由无色到最终变为黄棕色的颜色转变,直观地呈现了银纳米颗粒的合成。利用扫描电镜和紫外可见光谱对合成的银纳米粒子进行表征,结果见图3。以DMF为还原剂制备的银溶胶的紫外表征图(图3(a)),其在414 nm处存在一个最大吸收峰,表明其中的银纳米粒子为球形,且直径为50 nm左右[13]。紫外光谱的半峰宽窄,说明制得的银纳米颗粒粒径均匀。该银溶胶的SEM图(图3(b))显示,制备的银纳米粒子大致呈球形,直径为50 nm左右,与紫外表征结果相一致。

图3 (a) 银溶胶的紫外表征图谱和(b) 银溶胶的SEM图谱

2.4 D-SERS法检测

SERS检测技术通常是在湿态溶液或干态成膜中进行的,然而在这两种情况下都很难保证SERS基底的最大增强效果。此时,就要寻找一个最佳的基底状态,即“热点”来进行SERS检测,才能保证最大程度的增强效果。本实验使用现有的D-SERS方法[14-16]进行检测,即将银溶胶滴加到待测物斑点上,在纳米银溶胶由湿态转变为干态的过程中进行动态SERS检测。期间,银溶胶的纳米颗粒在溶剂蒸发产生的毛细引力作用下相互靠近,源源不断地产生SERS‘热点’,同时银溶胶也在不断地浓缩从而使SERS信号得到很大的提高。同一般的SERS检测方法相比,D-SERS方法具有很高的灵敏度和重现性,且无需样品的前处理,真正体现了拉曼光谱方法在快速检测方面的优势。

2.5 激光强度的考察

拉曼仪器的激光强度会对SERS检测信号产生影响,实验中随着激光强度的提高,SERS的检测信号也会逐渐增强,但当激光强度超过一定的临界值时,激光强度过高会引起待测物烧损,导致无法得到可用的SERS信号。本实验对不同的激光强度10%、20%、50%、80%、90%、100%进行了考察。结果显示,当激光强度从10%逐渐提高至80%,SERS检测信号也逐渐增强,而当激光强度超过80%,待测物斑点极易被烧灼,不利于SERS光谱的采集。因此,本实验最终选定激光强度为80%。

2.6 模拟阳性样品的检测

采用以DMF为还原剂和溶剂制备的银溶胶,按照TLC-SERS检测方法对模拟阳性样品和对照品进行检测,并同其原位SERS图谱进行比较,得到的结果如图4所示。从图中可以看出,以DMF为还原剂制备的银溶胶本身的特征峰有659、865、1 095、1 410、1 440 cm-1,其特征峰均来自溶剂DMF;舒必利SERS图谱主要的特征峰有674、795、923、1 168、1 246、1 597 cm-1;利培酮SERS图谱主要的特征峰有610、760、779、956、1 272、1 350 cm-1;奋乃静SERS图谱主要的特征峰有586、678、1 040、1 245、1 294、1 566 cm-1;卡马西平SERS图谱的主要特征峰有697、719、1 021、1 039、1 219、1 307、1 563、1 599 cm-1。从图4可以看出,对照品的原位SERS图谱、对照品的TLC-SERS图谱以及模拟阳性样品的TLC-SERS图谱的主要特征峰均一致,表明该方法具有良好的专属性。

2.7 检测限的考察

精密称取舒必利、利培酮、奋乃静、卡马西平对照品适量加入到抗精神失常类中药中,使其掺杂量梯度分别为2、1、0.5、0.2、0.1、0.05、0.02、0.01 mg/mL,按照制备模拟阳性对照品的方法进行溶液制备,再TLC-SERS检测。根据信噪比S/N为3时,确定各物质的最低检测限(LOD)分别为舒必利0.1 mg/mL、利培酮0.1 mg/mL、奋乃静0.05 mg/mL、卡马西平0.02 mg/mL。

(a)奋乃静(b)舒必利(c)利培酮(d)卡马西平

a-对照品的原位SERS图谱,b-对照品的TLC-SERS图谱,

c-模拟阳性样品的TLC-SERS图谱,d-银溶胶的空白图谱

图4 4种化合物的原位SERS和TLC-SERS图谱

2.8 真实样品检测

利用建立的TLC方法对6种抗精神失常类中药(编号1~6)进行检测,得到的结果如图5所示。图中结果显示,2号样品的色谱条带中出现了与舒必利对照品比移值相近的斑点;而4号样品的色谱条带中出现了与卡马西平比移值相近的斑点,说明2号样品可能添加了舒必利,4号样品中可能添加了卡马西平。

1~6-6种抗精神失常类中成药样品,7-舒必利,8-奋乃静,9-利培酮,10-卡马西平

图5 真实样品薄层色谱图

然而,由于中药体系十分复杂,仅凭TLC法并不能准确地确认是否掺杂了化药成分。为此做了进一步结果验证,即对2号和4号样品中出现的与对照品比移值相近的斑点处进行SERS光谱采集,并与其对应的对照品SERS图谱对比。图6结果显示,2号样品在与舒必利相应位置处斑点的SERS光谱和舒必利对照品的SERS光谱主要特征峰一致;4号样品在与卡马西平相应位置处斑点的SERS光谱和卡马西平对照品的SERS光谱主峰一致。因此可以初步判定,2号样品中添加了舒必利,4号样品中添加了卡马西平。

a-色谱条带中斑点处的SERS图谱,b-舒必利薄层展开处的SERS图谱

图6 2、4号样品SERS检测结果

3 结 语

本文建立了一种TLC-SERS法用于快速检测抗精神失常类中成药中化药成分的方法,并运用D-SERS方法成功检测出中成药中的化学掺伪成分。该方法同传统检测方法相比,具有简便快速、灵敏度高、准确性好的优点,为中药掺伪的现场快检提供了一种新的解决方案。

[1] 张小龙, 王 昆, 吴先富,等. 中药及保健食品中非法添加状况分析[J]. 中国药师,2014(10): 1749-1753.

[2] 赵向阳, 班永生, 朱 静. HPCE技术及其在中药分析中的应用[J]. 现代中药研究与实践, 2007, 21(4): 62-64.

[3] 黎雪清, 谭 渺, 蒋创杰, 等. HPLC法快速筛查抗风湿类中成药和保健食品中24种非法添加化学成分[J]. 中成药, 2014, 36(9): 1891-1894.

[4] 孙夏荣, 李 丹, 文红梅, 等. LC-MS/MS法快速测定中成药与保健食品中非法添加20种化学成分研究[J]. 中国药师, 2011, 14(1): 22-25.

[5] Polavarapu L, Porta A L, Novikov S M,etal. Pen-on-paper approach toward the design of universal surface enhanced Raman scattering substrates[J]. Small, 2014, 10(15): 3065-3071.

[6] Zhang L. Self-assembly Ag nanoparticle monolayer film as SERS Substrate for pesticide detection[J]. Applied Surface Science, 2013, 270(14): 292-294.

[7] Lucotti A, Tommasini M, Casella M,etal. TLC-surface enhanced Raman scattering of apomorphine in human plasma[J]. Vibrational Spectroscopy, 2012, 62: 286-291.

[8] Song X, Li H, Al-Qadiri H M,etal. Detection of herbicides in drinking water by surface-enhanced Raman spectroscopy coupled with gold nanostructures[J]. Journal of Food Measurement & Characterization, 2013, 7(3):107-113.

[9] Li D W, Qu L L, Zhai W L,etal. Facile on-site detection of substituted aromatic pollutants in water using thin layer chromatography combined with surface-enhanced Raman spectroscopy[J]. Environ Sci Technol, 2011,45(9):4046-4052.

[10] Lv D, Cao Y, Lou Z,etal. Rapid on-site detection of ephedrine and its analogues used as adulterants in slimming dietary supplements by TLC-SERS[J]. Analytical & Bioanalytical Chemistry, 2015, 407: 1313-1325.

[11] Yang J, Zhang F, Chen Y,etal. Core-shell Ag@SiO2@mSiO2mesoporous nanocarriers for metal-enhanced fluorescence[J]. Chemical Communications, 2011, 47(42): 11618-11620.

[12] Zhang Y, Shi R, Yang P. Synthesis of Ag nanoparticles with tunable sizes using N,N-dimethyl formamide[J]. J Nanosci Nanotechnol, 2014, 14(4):3011-3016(6).

[13] Yguerabide J, Yguerabide E E. Light-scattering submicroscopic particles as highly fluorescent analogs and their use as tracer labels in clinical and biological applications[J]. Analytical Biochemistry, 1998, 262(2): 157-176.

[14] Yang L, Li P,Meng L,etal., A dynamic surface enhanced Raman spectroscopy method for ultra-sensitive detection: from the wet state to the dry state[J]. Chem Soc Rev, 2015, 44(10): 2837-48

[15] Liu H, Yang Z, Meng L,etal. Three-dimensional and time-ordered surface-enhanced Raman scattering hotspot matrix[J]. J Am Chem Soc, 2014, 136(14): 5332-5341.

[16] Liu H, Sun Y, Jin Z,etal. Capillarity-constructed reversible hot spots for molecular trapping inside silver nanorod arrays light up ultrahigh SERS enhancement[J]. Chemical Science, 2013, 4(9): 3490-3496.

Rapid Detection of Chemical Drugs in Antipsychotic Traditional Chinese Medicine by TLC-SERS

WANGLei1,CHENMeng-yun2,LIXiao2,LUFeng2,XUJi-yang1

(1. Department of Biochemistry, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 2. Department of Pharmaceutical Analysis, Second Military Medical University, Shanghai 200433, China)

A rapid detection method was established for chemicals illegally added in Antipsychotic traditional Chinese medicine (TCM). The method used thin layer chromatography (TLC), and combined with surface-enhanced Raman scattering (SERS). After optimizing several experimental factors of the silver colloid, detection method of D-SERS and intensity of laser, TLC was used to separate TCM matrixes and four types of adulterated chemicals such as perphenazine, carbamazepine, risperidone and sulpiride. Trichloromethane, methanol and water (8∶2∶0.2) was used as the mobile phase and TCM was located under UV 254 nm, then the separated trace substances in TLC plant were tested by SERS method. In conclusion, the established specific and sensitive TLC-SERS technique could be used to detect the chemical adulteration in antipsychotic drugs of Chinese medicine, and the lowest limit of detection was to 0.02 mg/mL. Compared with the HPLC method, this method was simple, rapid and without sample pretreatment. In this case, the TLC-SERS method has potentially broad application in the fields of on-line fast screening.

surface enhanced Raman scattering; thin layer chromatography; traditional Chinese medicine; illegally added chemicals

2015-08-18

国家重大科学仪器专项(2012YQ180132)资助

王 磊(1990-),男,山东日照人,硕士生,主要研究方向为中药掺伪的表面增强拉曼研究。

许激扬(1964-),男,浙江金华人,教授,硕士生导师,研究方向为:手性药物合成。Tel.:025-83271306;E-mail:jiyangx@126.com

R 917

A

1006-7167(2016)05-0022-05

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