人CAP1蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体蛋白的相互作用

张 莹，刘 旭，王 彬，潘秀颉，杨陟华，周平坤，朱茂祥，顾永清

(1. 石河子大学医学院，新疆石河子 832003；2. 石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003；3. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850)



◇基础研究◇

人CAP1蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体蛋白的相互作用

张 莹1,3，刘 旭2,3，王 彬2,3，潘秀颉3，杨陟华3，周平坤3，朱茂祥3，顾永清1,3

(1. 石河子大学医学院，新疆石河子 832003；2. 石河子大学生命科学学院，新疆石河子 832003；3. 军事医学科学院放射与辐射医学研究所，北京 100850)

目的 在细胞水平及体外验证腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)蛋白与PIF1解螺旋酶及其剪接体是否存在相互作用。方法 采用激光共聚焦免疫荧光实验，通过细胞内蛋白共定位确定蛋白质间的相互作用关系；GST Pull-down实验在体外验证CAP1与PIF1及其剪接体是否存在直接的相互作用。结果 激光共聚焦免疫荧光实验显示，CAP1与PIF1全长蛋白及其剪接体BC018978没有共定位，但与剪接体AF108138C存在共定位。GST Pull-down未检测到CAP1与PIF1全长及其剪接体的相互作用。结论 CAP1与PIF1剪接体蛋白可能存在非直接相互作用。

腺苷酸环化酶相关蛋白1(CAP1)；PIF1；激光共聚焦免疫荧光；GST Pull-down

能使DNA双链解开形成单链的酶是DNA解螺旋酶，在几乎所有的核酸代谢过程中都很重要。因此，一些DNA解螺旋酶的突变会引起人类遗传病，如Bloom综合征、Werner’s综合征以及Rothmund-Tomson综合征等[1]。PIF1解螺旋酶家族在从酵母到人的进化中非常保守，对维持基因组的稳定非常重要。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PIF1蛋白在体内具有众多生理功能[2-6]，如参与DNA损伤修复、抑制端粒酶活性、参与冈崎片段的成熟、抑制rDNA复制、参与G4 DNA解聚等。

人类PIF1解螺旋酶的研究起步较晚。现有研究显示，人PIF1能调节端粒长度、G4 DNA的解链及抑制肿瘤细胞凋亡等生理活动[7-10]。已有研究显示，PIF1解螺旋酶在细胞癌变过程中也有发挥了重要的作用[11]。多种真核生物都有不止1个PIF1同源蛋白[2]。在本研究中我们发现，尽管人只有1个PIF1蛋白，但人PIF1具有多个剪接体，这可能弥补了其只有1个PIF1解螺旋酶的不足，多个剪接体可能具有不同生理功能，参与生物体内代谢。

CAP1(edenylyl cyclese-essocieted protein 1)即腺苷酸环化酶相关蛋白1，最先于酿酒酵母中被发现，名为CAP/Srv2。酿酒酵母中该类蛋白N端结构域可与腺苷酸环化酶Cyr1结合参与Ras信号通路，影响酵母细胞生长，C端结构域通过与G蛋白结合而影响Actin等肌动蛋白的聚合，参与调控细胞骨架的动态平衡。有研究表明，在人类细胞中CAP1蛋白C端结构域具有与酵母细胞中同样的功能，参与调控肌动蛋白的聚合，其N端结构域功能目前研究较少，是否参与Ras信号通路目前尚不能证实。在前期研究中，我们通过酵母双杂交实验筛选出CAP1蛋白与PIF1具有相互作用, 本研究旨在确定PIF1全长及其剪接体蛋白与CAP1的相互作用，为进一步全面了解PIF1及其剪接体的生理功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料 pMStRNA质粒由日本广岛大学Yuji Masuda博士惠赠；质粒Myc-CAP1、Flag-PIF1、Flag-PIF1N、Flag-PIF1C、pEGX-4T-1由本实验室保藏；LipofectamineTM2000购自Invitrogen公司；GST、Myc、His标签抗体购自Santa Cruz Biotechnology；Flag标签抗体购自Sigma公司；荧光标记二抗Alexa Fluor®488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody，Alexa Fluor®568 conjugate Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody购自Life Technologies公司。

1.2 激光共聚焦免疫荧光实验 于60 mm培养皿中先放置细胞玻片，按1×104/皿接种细胞，待长至12 h转染质粒。具体转染程序按LipofectamineTM2000操作说明进行。12 h后将细胞玻片放置于6孔板中，PBS清洗3次，预冷的40 g/L多聚甲醛4 ℃固定备用。PBS清洗3次，2.5 mL/L Triton 100破膜20 min，10 g/L BSA室温封闭30 min。一抗湿盒内4 ℃过夜。PBS清洗3次，荧光二抗室温避光孵育1 h。PBS清洗3次，滴加DAPI，湿盒内室温避光孵育20 min。100 mL/L甘油封片，湿盒避光保存。激光共聚焦显微镜观察。

1.3 CAP1原核表达重组质粒的构建 以pEGX-4T-1质粒为载体，构建带GST标签的CAP1蛋白原核细胞表达重组质粒。生物信息学网站查ORF框，并设计引物。F：5′-CGCGTCGACCATGGCTGACATGCAAAATCT-3′，R，5′-GGAAGATCTCTTATCCAGCAATTTCTGTCAC-3′。反应总体系50 μL，反应条件为：94 ℃ 2 min变性，98 ℃ 10 s退火，68 ℃ 2 min延伸，38个循环。限制性内切酶SalⅠ和NotⅠ双酶切PCR产物及pGEX-4T-1，凝胶回收纯化后，将目的片段与线性化pGEX-4T-1载体连接，构建GST-CAP1，送公司进行测序鉴定。

1.4 蛋白的原核诱导表达 将GST-CAP1与pMStRNA质粒共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，挑取单克隆接种到3 mL双抗培养液中，37 ℃培养过夜，第2天接种至新的10 mL双抗培养液中，20 ℃培养。待长至对数生长期时，收菌1 mL作为0 h 样品，余下菌液中加入IPTG，每隔2 h收菌1次，并检测各时间点菌液A600值。加入相应2×loading buffer，100 ℃煮沸5 min，离心后取上清用于后续考马斯亮蓝染色及Western blot检测。

1.5 考马斯亮蓝染色 将处理好的样品取上清10 μL 进行SDS-PAGE电泳分离，然后将分离胶部分浸泡于考马斯亮蓝染液中，置于摇床上室温下缓慢摇动4 h。将染色后的分离胶浸泡于脱色液中，置于摇床上缓慢摇动，直至可看到清晰条带为止。

1.6 Western blot检测 取处理好的样品上清10 μL进行SDS-PAGE电泳分离，先80 V恒压电泳30 min，再120 V电泳1 h。100 V恒压湿转转膜70 min，50 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h。一抗(1∶1 000)4 ℃孵育过夜。TBST洗膜，8 min/次，共3次。相应二抗(1∶4 000)室温孵育1 h。TBST洗膜，8 min/次，共3次。ECL显色。

1.7 GST Pull-down实验 GST-CAP1的原核诱导表达菌体，经细胞重悬、超声裂解，离心取上清。上清中加50%谷胱甘肽-琼脂糖珠悬液制备结合GST融合蛋白谷胱甘肽-琼脂糖珠，PBS清洗3次。同时，His-PIF1、His-PIF1C和His-PIF1N原核诱导表达菌体，也经细胞重悬，超声裂解，离心取上清，分别加入各GST融合蛋白反应体系中。100 g/L SDS-PAGE分离蛋白样品，行Western blot分析。

2 结 果

2.1 人PIF1的生物信息学分析 人PIF1基因位于染色体15q22.31(图1A)，含有13个外显子，共覆盖10 000 bp基因组序列(图1B)。人PIF1cDNA全长2 682 bp，GenBank开放阅读框(ORF)长1 926 bp(GenBank accession number, EU084033)，编码一个含有641个氨基酸的蛋白质，计算PIF1蛋白分子质量为70 ku。GenBank数据库分析显示，人PIF1有多个剪接体(图1C)，剪接体的GenBank accession number分别为BC018978、AF108138、AK026345、BC033254，其中分子质量最小的剪接体BC018978，含2个外显子，分子质量最大的剪切体AF108138，含11个外显子。多个剪接体提示PIF1具有众多的复杂功能，剪接体也直接参与生物体内代谢功能。

图1 人PIF1的生物信息学分析Fig.1 Bioinformatics analysis of human PIF1

DNA解螺旋酶的一个重要特征是在解螺旋酶的一级结构中存在一些高度保守的氨基酸序列，被称作解螺旋酶模序(helicase motif)，对解螺旋酶的功能起重要作用。经分析PIF1解螺旋酶结构域位于剪切体AF108138。此外，在前期研究中，我们通过生物信息学分析，发现PIF1解螺旋酶家族不仅7个解螺旋酶区域在进化中高度保守，其解螺旋酶模序的上游，PIF1蛋白的N-末端在进化中也很保守，具有较高的同源性。我们将其命名为PINT功能域(PIF1 N-terminal, domain)，经分析PINT结构域位于剪切体BC018978。

2.2 激光共聚焦免疫荧光实验分析PIF1剪接体与CAP1存在细胞内共定位 将PIF1全长cDNA、包含PINT结构域的N端(剪接体BC018978)、包含解螺旋酶模序的C端(剪接体AF108138)，分别插入带Flag标签的pCMV-Tag 2B真核表达载体，产生重组质粒命名为Flag-PIF1、Flag-PIF1N和Flag-PIF1C。CAP1插入真核表达载体PCMV-Myc，产生重组质粒命名为Myc-CAP1。Flag-PIF1、Flag-PIF1N和Flag-PIF1C分别与Myc-CAP1共转染HeLa细胞，激光共聚焦分析CAP1及其剪接体是否存在细胞内共定位。结果显示，PIF1全长主要存在于细胞核，CAP1主要存在于细胞质，二者在细胞内没有共定位(图2)。PIF1N也主要存在于细胞核，与CAP1没有共定位(图3)，而PIF1C主要存在于细胞质，与CAP1在细胞内共定位(图4)。

图2 CAP1蛋白与PIF1全长蛋白在细胞内的定位Fig.2 Intracellular location of CAP1 and PIF1 full-length protein

图3 CAP1蛋白与PIF1N蛋白在细胞内的定位Fig.3 Intracellular location of CAP1 and PIF1N protein

图4 CAP1蛋白与PIF1C蛋白在细胞内的定位Fig.4 Intracellular location of CAP1 and PIF1C protein

2.3 GST Pull-down实验体外验证PIF1及其剪接体蛋白与CAP1的相互作用

2.3.1 CAP1原核表达重组质粒的构建 CAP1 cDNA全长2 781 bp，开放阅读框ORF 1 428 bp。以HeLa细胞cDNA为模板经PCR扩增CAP1 ORF(图5)，PCR产物酶切后插入原核表达重组质粒pGEX-4T-2得到原核表达重组质粒，测序正确，命名为GST-CAP1。

图5 CAP1原核表达重组质粒的构建Fig.5 Construction of the prokaryotic expression recombinant plasmids of CAP1

PIF1全长基因及其剪接体蛋白插入带his标签的原核表达载体pET15b，命名为His-PIF1、His-PIF1N、 His-PIF1C。

2.3.2 原核诱导表达蛋白的鉴定 将原核表达质粒GST-CAP1与pMStRNA质粒共同转化BL21菌株感受态细胞，经诱导表达后，按不同时间点收菌液。经考马斯亮蓝染色及Western blot验证，得到特异性条带，与预计分子质量大小一致，表达量随时间延长而增加，表明GST-CAP1在大肠杆菌成功表达(图6)。

图6 GST-CAP1原核诱导表达Fig.6 The prokaryotic-induced expression of GST-CAP1

带His标签的PIF1全长及其剪接体重组质粒His-PIF1、His-PIF1N、His-PIF1C经考马斯亮蓝染色及Western blot验证，也得到与预计分子质量大小一致的特异性条带70、55、22 ku，且条带浓度随时间延长而增加，表明上述原核表达质粒均能够实现诱导表达(图7～图9)。

图7 His-PIF1原核诱导表达Fig.7 The prokaryotic-induced expression of His-PIF1

图8 His-PIF1N原核诱导表达Fig.8 The prokaryotic-induced expression of His-PIF1N

图9 His-PIF1C原核诱导表达Fig.9 The prokaryotic-induced expression of His-PIF1C

2.3.3 GST Pull-down验证蛋白相互作用关系 首先PIF1全长及剪接体蛋白的Input分别在70、55、22 ku 处有特异性条带，CAP1蛋白Input也可见特异性条带，表明带GST标签的CAP1、PIF1全长及剪接体蛋白正确表达(图10)。但是，让我们意外的是，GST pull-down显示带GST标签的CAP1并不能把PIF1全长蛋白、PIF1N沉淀下来，甚至PIF1C也不能沉淀下来。

图10 GST Pull-down实验体外验证相互作用关系Fig.10 Verification of the interaction by GST Pull-downinvitro

3 讨 论

DNA遗传信息的读取需要其双链的打开并暴露出其中的碱基序列作为模版， DNA双链解开形成单链的酶是DNA解螺旋酶，在几乎所有的核酸代谢过程中都很重要，对维持基因组的稳定是必须的。因此一些螺旋酶突变会导致Werner综合征(Werner syndrome, WS)、Bloom综合征(Bloom syndrome, BS)等多种人类遗传疾病[1]。

PIF1解螺旋酶家族在从酵母到人的进化中非常保守。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)的PIF1蛋白对维持基因组的稳定具有重要作用，在体内具有众多生理功能[2-6]，如参与DNA损伤修复、抑制端粒酶活性、参与冈崎片段的成熟、抑制rDNA复制、参与G4 DNA解聚等。酿酒酵母还有一个PIF1同源蛋白-RRM3，似乎具有与PIF1不同的生理功能，例如促进rDNA复制，在RRM3缺失的酵母细胞中包括rDNA、tRNA、中心体DNA、端粒DNA均发现复制叉的停顿。

除酿酒酵母存在2个PIF1解螺旋酶外，在一些真菌基因组(如白色念珠菌，新型隐球菌)也编码2个PIF1家族解旋酶[2]，拟南芥有3种PIF1解旋酶，原生动物寄生虫有7到8种PIF1解旋酶。多种真核生物存在2种以上PIF1解螺旋酶提示PIF1家族解螺旋酶在体内功能众多，有些看起来互相拮抗，从而使生物体处于动态平衡具有不同功能，处于动态平衡，提示其具有非常重要的作用。

人PIF1全长直到2006年才首次被克隆，随后研究显示人PIF1具有调节端粒长度、参与G4 DNA的解链 、抑制肿瘤细胞凋亡等众多生理功能[7-10]。最近研究表明人PIF1解螺旋酶在细胞癌变过程中也发挥了重要的作用[11]。和酿酒酵母、拟南芥不同的是，人只有一种PIF1解螺旋酶。但是在本研究中我们发现，人PIF1有多个剪接体(图1)，剪接体的GenBank accession number分别为BC018978、AF108138、AK026345、BC033254，其中分子质量最小的剪接体BC018978，含2个外显子，分子质量最大的剪接体AF108138，含11个外显子。

DNA解螺旋酶的一个重要特征是在解螺旋酶的一级结构中存在一些高度保守的氨基酸序列，被称作解螺旋酶模序(helicase motif)，对解螺旋酶的功能起重要作用。经分析PIF1解螺旋酶结构域位于剪切体AF108138。此外，在前期研究中，我们通过生物信息学分析，发现PIF1解螺旋酶家族不仅7个解螺旋酶区域在进化中高度保守，其解螺旋酶模序的上游，PIF1蛋白的N-末端在进化中也很保守，具有较高的同源性[12]。我们将其命名为PINT功能域(PIF1 N-terminal, domain)，PINT功能域具有与解螺旋酶矛盾的使DNA双链退火的功能，经分析PINT结构域位于剪接体BC018978。PIF1具有多个剪接体可能弥补了其只有一个PIF1解螺旋酶的不足，多个剪接体可能具有不同生理功能，参与生物体内代谢。

为了进一步探索人PIF1及其有代表性的剪接体AF108138(本研究中我们命名为PIF1C)、BC018978(本研究中我们命名为PIF1N)的功能及作用机制，本研究旨在通过筛选PIF1全长、PIF1C及PIF1N的相互作用蛋白，以全面了解PIF1及其剪接体的生理功能。

在前期研究中，我们通过酵母双杂交实验，筛选到CAP1与PIF1具有相互作用。CAP1是一类广泛存在于真核生物的保守蛋白[13]，在人类肝癌、胰腺癌等多种癌细胞中均发现CAP1的表达变化，提示CAP1可能参与癌细胞的转移、侵入[14-15]。另有报道称其在肺癌细胞中存在生化性质转变并具有作为颅内肿瘤转移诊断标志物的潜在应用前景[16]。此外，在胰腺癌等多种癌细胞中，CAP1存在表达上调并推测可能促进细胞迁移[17]。而人PIF1解螺旋酶在细胞癌变过程中也发挥了重要的作用。因此，我们推测PIF1可能通过与CAP1相互作用发挥在肿瘤发生中的作用。

本研究首先通过激光共聚焦实验观察CAP1与PIF1全长及其剪接体是否在细胞内共定位，结果显示PIF1全长和PIF1N主要定位于细胞核，而CAP1定位于细胞质，所以PIF1全长和PIF1N与CAP1没有共定位。PIF1C主要在细胞质中表达，因此剪切体PIF1C与CAP1在细胞质内共定位。随后我们试图通过GST Pull-down实验进一步确定PIF1C与CAP1的相互作用，但是让我们意外的是带GST标签的CAP1并不能把PIF1全长蛋白、PIF1N沉淀下来，甚至PIF1C也不能沉淀下来。该结果提示有2种可能性：一是CAP1与PIF1及其剪接体的相互作用很可能是短暂的、微弱的，由于实验方法限制并不能灵敏的检测到。因为PIF1蛋白N-末端为一级去稳定残基的亮氨酸，容易通过泛素化标记被蛋白酶体降解，与之相对应的是PIF1在人体大部分组织中均低表达。因此，体内PIF1剪接体与CAP1的作用可能是短暂的，甚至是微弱的。在体外这种短暂的、微弱的相互作用由于实验方法限制并不能灵敏地检测到。二是PIF1C与CAP1的相互作用是间接的，还需要其他蛋白介导，而GST Pull-down实验只能检测蛋白质的直接相互作用。因此，我们还将选择其他的研究蛋白质相互作用的实验方法，如双分子荧光互补技术(Bimolecular fluorescence complementation, BiFC)[18-19]、Far-western blotting[20-21]，进一步验证PIF1剪接体与CAP1的相互作用。本研究对进一步揭示人类PIF1解螺旋酶的功能及其参与细胞生理、生化过程的机制具有积极的指导意义。

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(编辑 卓选鹏)

Interaction among human CAP1, PIF1 helicase and its splice variants proteins

ZHANG Ying1,3, LIU Xu2,3, WANG Bin2,3, PAN Xiu-jie3,YANG Zhi-hua3, ZHOU Ping-kun3, ZHU Mao-xiang3, GU Yong-qing1,3

(1. School of Medicine, Shihezi University, Shihezi 832003; 2. College of Life Sciences,Shihezi University, Shihezi 832003; 3. Department of Radiation Toxicology and Oncology, Beijing Institute of Radiation Medicine, Beijing 100850, China)

Objective To determine whether human CAP1 interacts with PIF1 helicase and its splice variants proteinsinvivoandinvitro. Methods The co-localization of protein was directly observed to determine the interaction between the proteins by confocal immunofluorescence assay. The GST Pull-down experiment was used to test the existence of a direct interaction between CAP1 protein and PIF1 or its splice variants proteins. Results By using confocal immunofluorescence assay, CAP1 protein and PIF1 protein or its splice variants BC018978 had no co-localization, but CAP1 and splice variants AF108138C were co-located in the cytoplasm. Experimental results of the GST Pull-down showed that there was not direct interaction between CAP1 and PIF1 or its splice variants proteins. Conclusion These results show that there may be indirect interaction between CAP1 and PIF1 splice variants proteins.

edenylyl cyclese-essocieted protein 1 (CAP1); PIF1; confocal immunofluorescence; GST Pull-down

2016-02-06

2016-05-26

国家自然科学基金资助项目(No.31160183, 31270894, 31470827)

Supported by the National Natural Science Foundation of China (No.31160183, 31270894 and 31470827)

顾永清. E-mail: yqgu96@163.com

R34

A

10.7652/jdyxb201606002

优先出版：http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20161010.1619.004.html(2016-10-10)