一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

陈翠腾 傅光华 万春和 陈 珍 朱春华 刘荣昌 傅秋玲 程龙飞 陈红梅 施少华 黄 瑜

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省禽病防治重点实验室福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州350013）

一株鸡源H9N2亚型禽流感病毒的分离鉴定

陈翠腾 傅光华 万春和 陈 珍 朱春华 刘荣昌 傅秋玲 程龙飞 陈红梅 施少华 黄 瑜*

（福建省农业科学院畜牧兽医研究所福建省禽病防治重点实验室福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福州350013）

从福州市某活禽市场采集的鸡泄殖腔棉拭子样品中分离出1株病毒，经血凝抑制试验（HI）和聚合酶链反应（PCR）方法鉴定为H9N2亚型禽流感病毒。在GenBank基因库中对该病毒株的3个基因片段的测序结果进行BLAST比对分析表明，3个基因片段均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因。HA基因遗传进化分析表明，该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97处于同一分支，与上海的鸡源分离株A/chicken/Shanghai/06/2015(H9N2)同源性最高，同源性为99.5%。

H9N2亚型禽流感病毒分离鉴定

禽流感（AI）是由正黏病毒科、流感病毒属、A型流感病毒引起的禽类感染。根据禽流感病毒对易感禽的致病性将其分为高致病性（HPAI）、低致病性（LPAI）和无致病性3种。H9N2亚型AIV，属于低致病性禽流感病毒，是家禽中最常见的病毒之一。H9N2亚型AIV最早于1966年从火鸡体内分离到[1]。陈伯伦等[2]于1994年报道从发病蛋鸡体上分离到H9N2亚型AIV。此后，H9N2亚型AIV在我国广泛存在，且多呈低致病性感染，并呈逐渐蔓延之势[3]。H9N2亚型AIV流行范围广、可造成宿主免疫力低下并诱发其他致病性微生物的协同作用，对养禽业造成严重危害。

本研究从福州市某活禽市场采集的泄殖腔棉拭子样品中分离出1株鸡源禽流感病毒，经血清学分析和分子生物学检测，确定该AIV分离株为H9N2亚型AIV。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料9～10日龄SPF鸡胚购自福州大北农生物技术有限公司；病料采自福州市某活禽市场。

1.1.2 仪器和试剂凝胶成像分析系统为®BIORAD公司产品；PCR仪为Eppendorf公司产品；TIANamp Virus RNA Kit病®毒RNA提取试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司；TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒、2×EasyTaqPCR SuperMix、Trans5α

Chemically Competent Cell均购自北京全式金生物技术有限公司；pMD18-T Vector、DNA Marker均购自TaKaRa公司；AIV型特异性血清、抗禽流感病毒HA亚型(H5、H7、H9亚型)血清购自哈尔滨兽医研究所，ND、EDS-76阳性血清购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 引物参照GenBank数据库上已发布的禽流感病毒M基因序列，运用Oligo 7软件设计A型禽流感病毒检测引物，参照已发布的HA和NA基因序列，设计H9亚型和N2亚型基因特异性引物，引物的具体信息见表1，引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 引物信息

1.2 方法

1.2.1 样品采集与处理用无菌棉拭子采集鸡群泄殖腔内容物，浸泡于1 mL含青霉素（2 000 IU/mL）和链霉素（2 000 IU/mL）的无菌PBS缓冲液（pH7.4）中，充分振荡混匀后，于8 000 r/min离心15 min，取上清经0.22 μm滤器抽滤后保存于-80℃备用。

1.2.2 病原的分离培养将处理好的样品经尿囊腔接种2枚10日龄SPF鸡胚，每枚0.3 mL，37℃孵育，每日观察3次，无菌收集48～72 h的胚液，无菌检验后继续传3代，无菌回收尿囊液，-20℃低温保存备用。

1.2.3 病毒的血凝活性测定及血凝抑制试验按照文献[4]的方法对病毒分离株进行血凝（HA）试验，然后以4个血凝单位的病毒液分别与抗NDV、EDSV-76及H5、H7、H9亚型禽流感病毒等标准阳性血清进行微量血凝抑制试验（HI）。

1.2.4 病毒PCR鉴定

1.2.4.1 病毒核酸的提取和反转录将病毒尿囊液按照TIANamp Virus RNA Kit病毒RNA提取试剂盒操作说明提取病毒核酸，再用TransScript®One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒按照说明书步骤反转录成cDNA。

1.2.4.2 目的基因的PCR扩增以cDNA作为模板，进行PCR反应。PCR反应体系50 μL：2×Easy-Taq®PCR SuperMix 25 μL，上、下游引物各1 μL，模板3 μL，ddH2O 20 μL。PCR扩增程序：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火30 s，72℃延伸40 s，35个循环；72℃延伸7 min，10℃保温。PCR产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

1.2.4.3 PCR产物克隆及序列分析将扩增的目的片段连接到pMD18-T载体，克隆到Trans5α感受态细胞，挑选阳性克隆菌送上海生工生物工程技术公司测序。测序结果进行BLAST比对分析，并用Lasergene软件包和MEGA6软件进行基因序列分析。

2 结果与分析

2.1 病毒的分离及血凝活性测定病毒分离株接种SPF鸡胚传代后，72 h内出现死亡，回收的胚液按常规方法测定血凝活性，结果表明可凝集1%鸡红细胞，血凝效价为25。

2.2 病毒血凝抑制试验按常规方法对SPF鸡胚尿囊液进行血凝抑制试验，结果表明含毒尿囊液仅被抗禽流感病毒H9亚型标准阳性血清特异性抑制，而不被抗EDSV-76、NDV和H5、H7亚型禽流感病毒等标准阳性血清所抑制。

2.3 病毒的RT-PCR鉴定用禽流感病毒A型特异性引物、H9亚型HA和N2亚型NA基因特异性引物扩增该分离株的反转录产物cDNA，1%琼脂糖凝胶电泳分析表明，扩增产物均与预期结果相符（见图1）。

2.4 目的基因测序结果及进化分析在GenBank基因库中对病毒株（A/chicken/Fujian/05/2015）的3个基因目的片段的测序结果进行BLAST比对分析，3个基因均属于H9N2亚型禽流感病毒的基因，该结果与血清学试验结果相符。HA基因遗传进化分析表明，该病毒分离株与代表株DK/HK/Y280/97

处于同一分支，与上海的鸡源分离株A/chicken/ Shanghai/06/2015（H9N2）同源性最高，同源性为99.5%；与常用疫苗株CK/SH/F/98、CK/SD/6/96、CK/ GD/SS/94的同源性依次为87.4%、87.9%、88.2%（见图2-图3）。

3 讨论

目前，H9N2亚型禽流感病毒已在家禽中建立了稳定的种系，广泛分布在世界各地[5-6]，虽然H9N2亚型AIV对养殖业的影响一般不表现为感染家禽导致大批死亡，该病毒感染家禽后，仅引起轻微的临床症状，有的则无临诊表现，但该型病毒感染容易引起继发感染并降低生产能力，给家禽养殖业造成严重经济损失[7-8]。尤其是对近年来新发感染人的H7N9亚型AIV的研究发现，其6个内部基因均含有H9N2亚型AIV的6个内部基因的重组痕迹[9]，提示我们在关注H5N1亚型高致病性禽流感病毒的同时，还应该加强对H9N2亚型低致病性禽流感病毒的研究和防控。

本研究分离的1株鸡源禽流感病毒，经血清学分析和分子生物学检测，确定该AIV分离株为H9N2亚型AIV。该病毒与中国近期流行于家禽中的H9N2亚型禽流感病毒的同源性较高，所扩增的3个片段均为禽源H9N2流感病毒的相应基因片段。Guan等[10]将欧亚种系H9N2亚型AIV的HA基因分为3个群系，其代表毒株分别为A/quail/Hong Kong/G1/97、A/Duck/Hong Kong/Y280/97和A/Duck/ Hong Kong/Y439/97；本研究分离的病毒株HA基因遗传进化分析表明，该AIV分离株与代表株A/ Duck/Hong Kong/Y280/97处于同一分支，与常用疫苗株的同源性较高。以上结果表明，流行于鸡群中的H9N2亚型流感病毒仍然处于一个较稳定的遗传演化过程。

[1]Hommee P,Easterday B.Characteristics of A-Turkey-Wisconsin-1966 virus[J].Avian Dis,1970,14(1)：66-74.

[2]陈伯伦,张泽纪,陈伟斌.禽流感研究I.鸡A型禽流感病毒的分离与血清学初步鉴定[J].中国兽医杂志,1994,20(10)：3-5.

[3]Sun Y,Liu J.H9N2 influenza virus in China：a cause ofconcern[J].Protein Cell,2015,6(1)：18-25.

[4]殷震,刘景华.动物病毒学[M].2版.北京：科学出版社,1997：736-767.

[5]Liu J H,Okazaki K,Mweene A,et al.Genetic conservation of hemagglutinin gene of H9 influenza virus in chicken population in Mainland China[J].Virus Genes,2004,29(3)：329-334.

[6]Guo Y J,Krauss S,Senne D A,et al.Characterization of the pathogenicity of members of the newly established H9N2 influenza virus lineages in Asia[J].Virology,2000,267：279-288.

[7]Brown I H,Banks J,Manvell R J,et al.Recent epidemiology and ecology of influenza A viruses in avian species in Europe and the Middle East[J].Dev Biol(Basel),2006,124：45-50.

[8]Nili H,Asasi K.Natural cases and an experimental study of H9N2 avian influenza in commercial broilerchickens of Iran [J].Avian Pathol,2002,31(3)：247-252.

[9]Liu D,Shi W,Shi Y,et al.Origin and diversity of novel avian influenza A H7N9 viruses causing human infection：phylogenetic,structural,and coalescent analyses[J].Lancet,2013,381 (9881)：1926-1932.

[10]Guan Y,Shortridge K F,Krauss S,et al.Two lineages of H9N2 influenza virus continue to circulate inland-based poultry in southeastern China[J].Intemational Congress Series,200l,1219：187-193.

Isolation and identification of a H9N2 subtype avian influenza virus strain from chicken

Chen Cuiteng Fu Guanghua Wan Chunhe Chen Zhen Zhu Chunhua Liu Rongchang

Fu Qiuling Cheng Longfei Chen Hongmei Shi Shaohua Huang Yu*
（Institute of Animal Husbandry and Veterinary Medicine,Fujian Academy of Agricultural Science,Fujian Key Laboratory of Poultry Disease Prevention and Control,Fujian Animal Disease Control Technology Development Center,Fuzhou 350013）

A strain of H9N2 subtype avian influenza virus was isolated from the chicken cloacal swab samples collected from a live poultry market in Fuzhou city.The virus was identified by hemagglutination-inhibition test(HI)and]polymerase chain reaction(PCR). Analyzed by BLAST in Gen Bank database,the three genes fragment were all derived from the genes pool of H9N2 subtype avian influenza viruses.The phylogenetic analysis of HA gene showed that the fragment of the isolated virus was similar to that of the representative strain DK/HK/Y280/97 lineage of H9N2 viruses and share 99.5%similarity with the strain A/chicken/Shanghai/06/2015 (H9N2)isolated from chicken in Shanghai.

H9N2 subtype avian influenza virus Isolation Identification

A

1003-4331（2016）06-0023-04

福建省农业科学院青年人才创新基金（2014CX-4）、公益类科研院所专项（2015R1023-9）、现代农业产业体系建设专项资金（CARS-43）、新世纪“百千万人才工程”国家级人选科研补助基金（NCNCMTPC-2009）、福建省优良蛋鸭品种与设施化养殖创新产业化工程项目（2014-2016）、福建省畜禽疫病防控技术重大研发平台（2014N2003）资助。

陈翠腾（1987-），女，硕士，研究实习员。研究方向：动物病原与分子生物学，E-mail：chencuiteng@163. com。

*通信作者：黄瑜（1965-），男，博士，研究员。研究方向：家禽传染病学，E-mail：huangyu_815@163.com。