血管内皮生长因子-D在乳腺癌淋巴转移中的临床意义

赵云霞，崔芳芹

（蚌埠医学院病理生理学教研室，蚌埠 233030）

血管内皮生长因子-D在乳腺癌淋巴转移中的临床意义

赵云霞*，崔芳芹

（蚌埠医学院病理生理学教研室，蚌埠 233030）

目的 探讨乳腺癌中血管内皮生长因子-D（VEGF-D）对淋巴管生成的作用及其与临床病理指标和预后的关系。方法 应用免疫组织化学S-P法检测120例乳腺癌组织中VEGF-D的免疫反应性，同时以D2-40、podoplanin标记微淋巴管，计数微淋巴管密度（LVD），分析其与临床病理指标及预后的关系。结果 乳腺癌组织中VEGF-D蛋白免疫反应阳性率、LVD值均明显高于乳腺纤维腺瘤组织；乳腺癌组织中VEGF-D蛋白免疫反应与淋巴结转移呈正相关，且LVD值与VEGF-D表达呈线性相关。结论 VEGF-D参与乳腺癌淋巴管生成，影响乳腺癌的预后。

乳腺癌；血管内皮生长因子D；微淋巴管密度

乳腺癌转移以淋巴转移为主，是乳腺癌进展中较早发生的事件。乳腺癌的淋巴道侵袭和转移是导致病人预后不良的重要因素，因此抗淋巴道转移成为乳腺癌治疗的新方向。肿瘤新生淋巴管在淋巴转移过程中起着重要作用［1-3］。血管内皮生长因子-D（vascular endothelial growth factor-D，VEGF-D）与其受体结合，通过酪氨酸激酶信号转导通路促进淋巴道内皮的增生和迁移［4］。有研究表明VEGF-D可促进瘤内淋巴管的生成和淋巴结转移［5］。Podoplanin是目前较特异的淋巴管标记物之一，D2-40特异性表达于淋巴管内皮细胞，而不表达于血管内皮细胞，因此目前被认为是淋巴管内皮细胞特异性标记物。肿瘤微淋巴管密度（lymphatic microvessel density，LVD）可反映肿瘤淋巴管的生成，是肿瘤淋巴转移独立的危险因子［6］。为揭示VEGF-D在乳腺癌淋巴转移中的作用，本研究观察了乳腺癌中VEGFD的反应性和LVD变化及其与临床病理指标的关系。

材料和方法

1 标本

收集2008年6月至2012年6月间蚌埠医学院病理学教研室（蚌埠医学院第一附属医院病理科）存档的手术切除的乳腺癌石蜡标本120例。术前患者未接受放、化疗及内分泌治疗，所有标本再次复查确认。患者年龄31～85岁，平均年龄53岁（中位年龄50岁）。标本中浸润性导管癌98例，其他22例。病理分级：Ⅰ级 18例；Ⅱ级78例；Ⅲ级 24例。参照TNM分期［7］，将标本按肿瘤大小分为3组：最大直径≤2.0cm者12例，直径为2.0～5.0cm者88例，最大直径＞5.0cm者20例。76例有淋巴结转移，44例无淋巴结转移。另随机选取同期乳腺纤维腺瘤标本30例作为对照。

2 试剂和方法

所有标本均经10%福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片（厚4μm），分别行HE染色和S-P法免疫组织化学染色，用已知阳性组织切片作为阳性对照，以PBS代替一抗作阴性对照。兔抗人VEGF-D、鼠抗人D2-40单克隆抗体购自福州迈新生物技术开发公司，鼠抗人podoplanin单克隆抗体购自上海晶美生物技术有限公司，工作浓度分别为1：500、1：70和1：200。

3 结果判断

VEGF-D在乳腺癌细胞的免疫反应阳性产物定位于细胞质。用染色强度、阳性细胞比例两个指标评定VEGF-D阳性表达水平。按染色强度评分：不着色0分，着色弱1分，着色清晰为2分，着色强3分。按阳性细胞所占的百分率评分：无细胞着色0分，着色细胞0～10%1分，10%～30%2分，30%～50%3分，50%以上4分。染色强度与阳性细胞比例相加，0～2分为阴性，3分（＋），4～5分（＋＋），6分（＋＋＋），7分（＋＋＋＋）。

D2-40、Podoplanin免疫反应阳性产物均定位于淋巴管内皮细胞，以胞质或胞膜呈棕黄色或棕褐色为阳性表达。本研究中D2-40、podoplanin标记均以表达阳性的淋巴管作为有意义的淋巴管，以此计算LVD值。淋巴管密度计数的方法参照文献［8］：先于低倍镜（×10物镜）下确定3个淋巴管数目最多的热点，然后在高倍镜（×40物镜）下计数，每个热点计数5个高倍镜视野的淋巴管数目，最终取3个热点格5个高倍镜下淋巴管平均数目作为肿瘤LVD值。

4 统计学处理

采用SPSS17.0统计软件对数据进行分析，LVD值两种不同检测方法间的比较采用t检验，VEGF-D免疫反应性与临床病理指标间关系的比较采用χ2检验和Fisher精确检验，VEGF-D免疫反应性与LVD值间关系的比较采用t检验及单因素方差分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。

结　果

1 乳腺癌组织中VEGF-D免疫反应性增强

VEGF-D免疫反应阳性产物为棕黄色或棕褐色的颗粒，位于细胞质中（图1）。乳腺癌组织中VEGF-D免疫反应性阳性率（82.50%）明显高于同期乳腺纤维腺瘤组织（23.33%）。

图1　VEGF-D免疫反应性在乳腺癌组织细胞质内的定位。比例尺，100μmFig.1　Localization of VEGF-D immunoreactivity in the cytoplasm of the mammary carcinoma tissue.Scale bar，100μm

2 乳腺癌组织中LVD增加

D2-40、podoplanin标记阳性的淋巴管管壁由单层内皮细胞排列而成，壁薄，管腔具有不规则形态，管腔中无红细胞。在癌周组织中淋巴管丰富，壁薄管腔大；中心区淋巴管少且管腔狭窄或呈条索状。以癌周组织中的淋巴管数目计数淋巴管密度，结果显示，癌周组织中D2-40阳性标记（图2A，图2B）的LVD值（28.32±6.63）和podoplanin标记阳性（图2C，图2D）的LVD值（27.88±6.19）明显高于同期乳腺纤维腺瘤组织，两者同时阳性的LVD值26.66 ±6.56。D2-40、podoplanin标记淋巴管数目的阳性率具有一致性（表1）。

图2　乳腺癌癌旁组织淋巴管的D2-40（A和B）和podoplanin（C和D）免疫组织化学标记。比例尺，100μmFig.2　D2-40（A and B）and podoplanin（C and D）immunohistochemical labelling of lymphatic vessels in the tissue adjacent to the breast carcinoma.Scale bar，100μm

表1　乳腺癌癌旁组织中　D2-40与　Podoplanin标记的微淋巴管密度Table 1　D2-40-and podoplanin-labelled LVD in the tissue adjacent to the breast carcinoma

3 乳腺癌中VEGF-D免疫反应性与淋巴结转移呈正相关

76例有淋巴结转移的乳腺癌组织中VEGF-D免疫反应阳性率为88.16%，高于无淋巴结转移组，VEGF-D免疫反应性与淋巴结转移呈正相关，而与肿瘤病理类型、肿瘤分级及大小等其他多个病理指标间无相关性（表2）。

4 VEGF-D免疫反应性与LVD值的关系

120例乳腺癌患者中，99例VEGF-D免疫反应阳性病例中LVD值为28.66±4.90，高于阴性组的LVD值17.24±5.07，两者之间呈线性相关（表3）。

表2　VEGF-D免疫反应性与乳腺癌临床病理指标的关系Table 2　Correlation between VEGF-D-immunoreactivity and clinicopathological features in breast carcinoma

表3　乳腺癌组织中VEGF-D免疫反应性与LVD值的关系Table 3　Relationship between VEGF-D-immunoreactivity and LVD in breast carcinoma

讨　论

长期以来人们试图阻断肿瘤的血道转移以改善肿瘤预后，但效果并不理想。而临床观察证实，淋巴转移是多种肿瘤发展过程中的早期事件。淋巴转移也是决定乳腺癌分期和治疗方案的关键因素之一，是影响乳腺癌疗效和预后的重要因素。因此阻断肿瘤淋巴转移成为改善肿瘤预后的可能途径。D2-40目前被认为是特异性较强的淋巴管内皮细胞标记物，它在成熟的淋巴管上不表达，但在多种肿瘤新生淋巴管内皮呈免疫反应阳性［9］，例如，在胃癌［10］、前列腺癌、和肾癌［11］等肿瘤的淋巴管内皮都呈D2-40免疫反应阳性。本研究发现，D2-40标记的乳腺癌组织中的微淋巴管在癌周区域管腔大，密度高，而癌中心区仅为裂隙状或条索状微淋巴管结构，且数量少。由此提示，肿瘤的淋巴转移可能是通过癌周的新生淋巴管实现的。Podoplanin亦被认为是较特异的淋巴管内皮标记物之一，是检测肿瘤内部新生的淋巴管较可靠的指标［12］。本研究中采用D2-40和podoplanin标记同一乳腺癌组织中的淋巴管内皮细胞并分别计数LVD值，发现两者免疫反应性相似，用两种方法标记乳腺癌组织测得的LVD值相近，且都与对照组有显著差异。因此认为两种标记物在淋巴管内皮细胞的表达无差异，均能客观地反应肿瘤组织内部淋巴管新生情况，均为可靠的特异性的淋巴管内皮细胞标记物。此结果与文献报道一致［13］。

近来的研究表明，肿瘤淋巴转移并非是被动的，而是一个主动过程。某些因子刺激会促进淋巴管的生成，而新生淋巴管是导致淋巴转移的先决条件［14］。目前研究最多的促淋巴转移的因子就是血管内皮生长因子VEGF-C和VEGF-D及其受体。VEGF-D及其受体在直肠癌、宫颈癌和胃癌等多种肿瘤中被认为与淋巴转移密切相关，且被认为是肿瘤独立的预后不良指标［13，15，16］，但对乳腺癌的预后价值仍存在较大争议。目前研究表明，VEGF-D通过旁分泌和自分泌的形式发挥作用，肿瘤细胞合成和分泌的VEGF-D可诱导其受体 VEGFR-3表达，进而活化CRB2／ERX1／2及PI3K／AKT信号通路，触发MAPK级联反应，促使淋巴管内皮细胞增殖及淋巴管新生，为肿瘤淋巴转移提供条件。前期研究已证实VEGF-3在乳腺癌的淋巴转移中具有作用，是乳腺癌淋巴管生成的重要诱导因子［17］。本研究结果显示，VEGF-D在乳腺癌肿瘤细胞中表达显著增高，其表达与淋巴结转移有关，且VEGF-D免疫反应阳性的乳腺癌组织中LVD值显著高于阴性组，由此推断在乳腺癌组织中VEGF-D合成和分泌增多，与其受体结合后通过相应的信号转导通路促使肿瘤内部淋巴管的生成，导致淋巴转移，而淋巴转移是乳腺癌预后的重要影响因素，因此认为VEGF-D的高表达与乳腺癌的淋巴转移和不良预后有关［18，19］。由此可见，VEGF-D在乳腺癌的淋巴管生成中具有重要作用，影响乳腺癌的侵袭和转移，可作为乳腺癌重要的预后指标。

乳腺癌淋巴转移往往发生较早且预后差，因此抗淋巴转移治疗是乳腺癌治疗的重要方向。本研究结果提示腺癌组织中的D2-40、podoplanin和VEGFD的表达可以初步评估肿瘤的侵袭和转移能力，为乳腺癌患者的下一步临床治疗提供参考，且 VEGF-D所涉及的信号转导通路可能成为乳腺癌靶向治疗的新路径。

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The clinical significance of vascular endothelial growth factor-D in lymphatic metastasis of breast cancer

Zhao Yunxia*,Cui Fangqin
（Department of Physiopathology，Bengbu Medical College，Anhui 233030，China）

Objective To investigate the role of vascular endothelial growth factor-D(VEGF-D)in the lymphangiogenesis of breast cancer and to evaluate its relationship with the clinicopathological characteristics and prognosis.Methods The S-P immunohistochemical method was used to detect VEGF-D immunoreactivity in 120 cases of breast cancer,and lymphatic endothelial cells were marked with D2-40 and podoplanin simultaneously.Lymphatic vessel density(LVD)was then counted,and its relationship with the clinical pathological parameters and prognosis of breast cancer was analyzed.Results Both the positive rates of VEGF-D and LVD were significantly higher in breast cancer than in breast fibro-adenoma tissue.VEGF-D immunoreactivity was positively associated with the lymph node metastasis of breast cancer.LVD was linearly correlated with the expression of VEGF-D.Conclusion VEGF-D affects breast cancer prognosis through facilitating lymphangiogenesis.

Breast cancer；vascular endothelial growth factor-D；lymphatic vessel density

R73-37

A

10.16705／j.cnki.1004-1850.2016.05.011

2015-11-21

2016-10-08

安徽省教育厅高校自然科学基金项目（KJ2015B106by，KJ2016A867）

赵云霞，女（1977年），汉族，讲师

（To whom correspondence should be addressed）：zhyx201312＠163.com